Наш протокол описывает генетическую модификацию клеток CAR-T во время их производства с помощью технологии CRISPR для создания более эффективного и менее токсичного продукта. Преимуществом этого метода является то, что производство клеток CAR-T и генетические манипуляции могут происходить в одной клетке с хорошей эффективностью. Демонстрация процедуры будет Розали Стернер, доктор философии студент, Мишель Кокс, технолог и аспирант, и Реона Sakemura, аспирант, из моей лаборатории.
Изолировав Т-клетки от собранных периферических моноядерных клеток крови, начните их культивирование, сначала подготовив Т-клеточную среду, а затем стерилизовав ее, фильтруя ее через 0,45-микрометровый стерильный вакуумный фильтр, а затем с помощью стерильного вакуумного фильтра 0,22 микрометра. В день стимуляции Т-клеток или нулевой день, до стимуляции, мыть CD3/CD28 бусы, поместив необходимый объем бисера в стерильной 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки и повторно в один миллилитр ТКМ. Поместите трубку в контакт с магнитом в течение одной минуты.
Затем аспирировать ТКМ и повторно в один миллилитр свежего ТКМ мыть бисер снова и повторить в общей сложности три моет. И, наконец, повторно помыть бисер в один миллилитр ТКМ. После подсчета Т-клеток, передать бисер т-клеток в соотношении трех к одному бисера к клеткам.
Затем разбавить клетки до конечной концентрации одного миллиона клеток на миллилитр и инкубировать при 37 градусах по Цельсию, 5%CO2 в течение 24 часов. После приобретения конструкции CART19 в лентивирусном векторе, выполните лентивирусное производство с помощью первой инкубационные лентивирусные плазмиды, вектор упаковки, вектор конверта, прекомплексирующий реагент, трансфектонный реагент и трансфектную среду при комнатной температуре в течение 30 минут. Проведение лентивирусной работы с использованием BSL2'precautions, включая капюшоны клеточной культуры, средства индивидуальной защиты и дезинфекцию использованных материалов отбеливателем перед утилизацией.
После инкубации добавьте эти трансфектные реагенты в 293 Т-клетки, которые достигли 70-90% слияния и культуры трансфицированных клеток при 37 градусах Цельсия и 5%CO2. В течение 24 и 48 часов после трансфекции, урожай, центрифуга, фильтр и концентрат, содержащий вирус супернатант ультрацентрифугации и заморозить при температуре минус 80 градусов по Цельсию для использования в будущем. В первый день, мягко повторного T-клеток, которые были стимулированы на один миллион клеток на миллилитр в день нуля, с тем чтобы разбить розетки клеток.
В соответствии с соответствующими мерами предосторожности BSL2, добавьте свежий или замороженный собранный вирус в смоделированные Т-клетки при множественности инфекции 3.0. Продолжайте инкубировать трансдуцированные Т-клетки при 37 градусах Цельсия, 5%CO2. В дни три и пять, рассчитывать CAR-T клеток и добавить свежие предварительно разогретых TCM в культуру для поддержания концентрации CAR-T клеток одного миллиона клеток на миллилитр.
Через шесть дней после моделирования, удалить бисер из транс индуцированных Т-клеток путем первого сбора урожая и повторного перерасхода клеток. Перенесите клетки в 50 миллилитровых конических трубок и поместите трубки в магнит на одну минуту. После сбора CAR-T-клеток, содержащих супернатант и отбрасывая бисер, место клетки обратно в культуре в концентрации одного миллиона клеток на миллилитр в культуре колбу.
Используйте образец клеток для цитометрии потока для оценки поверхностного экспрессии CARs. Инкубировать остальные, чтобы возобновить расширение, а затем урожай и крио-сохранить клетки на восьмой день, как описано в рукописи. Чтобы нарушить гранулоцитов макрофаг колонии стимулирующий фактор, используйте руководство РНК, как описано в рукописи.
Инкубация трансфектных реагентов при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации, добавить их к 293 Т-клеток, которые достигли 70 до 90% слияния и культуры трансфицированных клеток при 37 градусов по Цельсию, 5%CO2 для производства лентивируса. В 24 и 48 часов, урожай и концентрат, содержащий вирус супернатант ультрацентрифугации в 50 миллилитров ультрацентрифуг трубки и заморозить при температуре минус 80 градусов по Цельсию для использования в будущем.
Затем в первый день, осторожно повторно Т-клеток, чтобы разбить розетки. В лаборатории, одобренной BSL2, для генерации клеток CAR-T, добавьте lentivirus CAR19 и GMCSF-таргетинга CRISPR лентивируса для моделируемых Т-клеток. На третий день и пятый день для успешно трансдуцированных lentiCRISPR-редактируемых Т-клеток, несущих устойчивость пуромицина, лечить клетки с пуромицин дигидрохлоридом при концентрации одного микрограмма пуромицина на миллилитр.
Приливное секвенирование было использовано для подтверждения сокращения GM-CSF в GM-CSF нокаутом CART19 клеток с эффективностью нарушения примерно 71%Flow участков CAR-T поверхности поверхности окрашивания закрыты на живых CD3-положительных клеток показывают, что как дикий тип CART19 и GM-CSF нокаутОМ CART19 успешно и аналогичным образом выразить рецептор поверхности ЦАР в пробирке. С другой стороны, внутриклеточное окрашивание ГМ-CSF по цитометрии потока также закрыто на живых CD3-положительных клетках демонстрирует снижение экспрессии ГМ-CSF в нокаут-клетках по сравнению с клетками дикого типа CART19, подтверждающими функциональный успех нокаута. Особое внимание следует принимать во время трансдукционных этапов этой процедуры, поскольку они являются наиболее важными для развития генетически модифицированных клеток CAR-T.
Описанная методология потенциально может быть применена к различным генам для модификации клеток CAR-T с помощью CRISPR/CAS9, чтобы помочь создать менее токсичный и более эффективный продукт. Технология CRISPR/CAS9 предоставляет стратегии непосредственной таргетинга генома клеток CAR-T на разработку решений текущих клинических недостатков.
