Понимание физической основы самосожасывки белка в клетках ограничено отсутствием соответствующих инструментов. Современные методы страдают от низкой чувствительности, косвенных считывания, ограниченной пропускной способности и/или разрешения уровня населения. В отличие от этого, наш анализ обнаруживает и количественно склонность белка к самосвалу in vivo с чувствительной, одноклеточной, высокой пропускной способностью считывания независимо от локализации белка или solubility.
При первой попытке анализа, получение права преобразования фотографии может потребовать некоторых эмпирических испытаний для получения оптимальных условий для достижения хорошего считывания по всей пластине. Чувствительность анализа также может быть скомпрометирована, если цитометр не имеет отдельных фильтров обнаружения сигналов FRET и acceptor. Демонстрацией процедуры со мной будет Эндрю Бокс, руководитель лаборатории цитометрии ядра.
Чтобы подготовить дрожжевой культуры для DAmFRET, для каждого запроса белка, привить преобразованных колоний дрожжей в трилировать в 200 микролитров соответствующих не вызывающих рост среды в отдельных скважин 96 хорошо круглые нижней пластины культуры. Инкубировать дрожжевые клетки с встряхивания с орбитой 1,5 миллиметра на 1200 оборотов в минуту при 30 градусах по Цельсию в течение 16 часов. В конце инкубации осадочные клетки дрожжей путем центрифугации и удаляют супернатанты с помощью сильной инверсии.
Добавьте 200 микролитров соответствующей индукционной среды и верните клетки в трясущимся инкубатором еще на 12 часов. В конце инкубации осадочные клетки дрожжей путем центрифугации и сильной инверсии, затем добавляют 200 микролитров свежей индукционной среды. Затем инкубировать клетки с встряхивания в течение еще четырех часов, чтобы уменьшить аутофлуоресценцию.
Чтобы фото конвертировать образцы, поместите пластину без крышки под ультрафиолетовую лампу, оснащенную фильтром от 320 до 500 нанометров и коллиматором пучка, расположенным на 45 сантиметров над пластиной. Включите лампу, чтобы фото преобразовать клетки в течение 25 минут с встряхивания. Для сбора данных DAmFRET загрузите фото преобразованные клетки на цитометр потока изображений с не колинеарными лазерами 488 и 561 нанометров и воротами четырех одиночных незабитых ячеек высокой круговоротом и небольшой клеточной площадью.
Затем соберите данные для двух-пяти раз от 10 до четырех одиночных ячеек на образец в рамках флуоресценции положительных ворот. В конце анализа используйте не-фото преобразованный образец mEos3.1 для чистого донорского сигнала и мономерного DsRed два для чистого сигнала принятия, чтобы установить компенсацию. Для большей чувствительности убедитесь, что канал детектора FRET также рассматривается в качестве цели распространения в программе анализа.
Рассчитайте параметр AmFRET как соотношение общего сигнала FRET, разделенного на общий сигнал-приемник FRET. AmFRET профили дрожжевых клеток, выражают флуоресцентный белок только экспонат незначительные AmFRET в то время как дрожжевые клетки, выражают как стабильный гомоолигомер сливается с флуоресцентным белком демонстрируют единые положительные значения AmFRET. Изображения клеток, приобретенных с помощью цитометрии потока изображений, показывают диффузную флуоресценцию во всех каналах.
Конфокалятивная микроскопия стеков для нескольких полей клеток показывает равномерное распределение флуоресценции по всему цитозолу каждой клетки без обнаруживаемой панкты. Дрожжевые клетки, выражают флюорофор в одиночку или флюорофор плюс мутантная форма человека воспламеняя белка проявляют незначительный AmFRET по всему диапазону концентрации, указывающий на неспособность к самостоятельному взаимодействию. В отличие от этого, дикий тип воспламеняемого белка демонстрирует профиль DAmFRET с одной незначительной популяцией AmFRET и одной высокой популяцией АмФРЕТ.
Обратите внимание, что дикий тип воспламеняя белок сопротивляется самосборке даже при высоких концентрациях с переходом белка на самосборную форму лишь в части клеток. Это является четким свидетельством существования нуклеаляции барьер для самосожасывания. Как подтверждается флуоресценцией изображения, эти популяции представляют клетки, которые содержат либо растворимый белок только или в основном самостоятельно собранный белок соответственно.
Действительно, DAmFRET подтверждает предыдущие структурные данные о том, что точечный мутант в воспламене нарушает нуклеацию в концентрациях, достижимых этой системой выражения. Обратите внимание, что профили экспрессии белка в клетках млекопитающих, которые не имеют экспрессии Caspase-1, напоминают те, которые наблюдаются в дрожжевых клетках. Самый важный шаг, чтобы помнить, это преобразование фотографии.
Другие важные шаги включают сбор достаточного количества событий, которые не насыщены для сигнала флуоресценции и получить компенсацию правильно. После анализа с соответствующей биохимии, рационального мутагенеза и структурной биологии подходы могут помочь в полной мере прояснить механизм самосъемки.
