Этот протокол помогает упростить измерения электроретинограмм или ERGs в личинки зебры, которая обеспечивает важную функциональную считывание визуального развития и генетических моделей заболеваний. Мягкие кончики губки записи электродов, используемых в этом протоколе, просты в изготовлении с использованием экономичных и легкодоступных материалов и позволяет избежать потенциального повреждения личиночных глаз. Мягкий электрод с наконечником губки может облегчить повторные измерения ERG одного и того же глаза.
Лица, новые для этой процедуры может быть трудно работать под тусклое красное освещение, которое используется на протяжении всей процедуры. Но важно, чтобы темная адаптация сохранялась. Чтобы подготовить конусообразную губку, записывающую электрод, вырежьте конец из платинового электродного свинцового расширения и используйте скальпель, чтобы удалить 10 миллиметров внешнего полиэтиленоэтиленового изоляционного покрытия с нового конца расширения.
Вырежьте 40-миллиметровый кусок серебряной проволоки диаметром 0,3 миллиметра и переплетай серебряную проволоку с открытым внутренним проводом, чтобы надежно прикрепить провод к электроду свинца. Обвяжай сустав изоляционной лентой, оставляя под воздействием примерно 15-миллиметровую длину серебряной проволоки. Подключите другой провод к отрицательному терминалу батареи и погрузите другой конец провода в солевой раствор.
Погрузите открытый серебряный провод в нормальный солевой раствор и соедините другой конец с положительным терминалом источника прямого тока в девять вольт. Через 60 секунд поместите проволоку на абсорбянтную ткань, чтобы высохнуть. В то же время, вырезать 20 на 20 миллиметров квадрат поливинил ацетат губки в конус форму и насытить губку в один раз Ringer буфера.
Под световым микроскопом с штангой масштаба на окуляре используйте лезвие скальпеля, чтобы сформировать вершину конуса диаметром около 40 микрометров. Воздух-сухой конусообразной губкой на абсорбентной бумаге ткани, пока она не будет твердой. Перед вставкой серебряной проволоки в высушенный твердый конусообразный поливинил ацетат губки через основание конуса, используя маску ленты, чтобы изолировать любой избыток подвергаются металла для уменьшения фотоэлектрических артефактов.
В день эксперимента погрузите электрод с наконечником губки в буфер Ringer в течение 15 минут, чтобы полностью насытить губку. По крайней мере, за восемь часов до записи, поместите не более 20 личинок зебры в одну 15 миллилитровую трубку без крышки и завернутые в алюминиевую фольгу в темном инкубаторе. В конце инкубации вылейте темно-адаптированную зебру в чашку Петри под тускло-красным освещением от светоизлучающего диода.
Чтобы подготовить губку платформы, вырезать кусок поливинил ацетат губки примерно равна по толщине до глубины 35 миллиметров Петри блюдо так, что губка будет плотно вписываться в блюдо. Сделайте небольшой разрез вертикально через один конец губки для размещения серебряной проволоки эталонного электрода и замочите губку в буфере золотой рыбки Ringer до тех пор, пока губка не насытится. Затем поместите губку в чистую 35-миллиметровую чашку Петри и используйте бумажное полотенце, чтобы поглотить дополнительную жидкость, пока ни один раствор не источает губку в ответ на легкий пресс пальца.
Чтобы распоставить животное для эксперимента, используйте трехмиллиметровый пипетки Pasteur для переноса обезболивающего личинки на трех на три сантиметра площади бумажного полотенца и используйте типсы, чтобы поместить квадрат на увлажненной губкой. Используя тонкую кисть, пропитанную буфером Ringer, отрегулируйте положение личинки одним глазом вверх и подальше от любой жидкости на полотенце под личинкой. Глазурь личинки тела с увлажняющим гель для глаз, чтобы держать животное гидратированных всей записи электроретинограммы.
И поместите блюдо на небольшой, нагретой водой платформе перед чашей Ganzfeld свет стимул, расположенный внутри клетки Фарадея. Вставьте эталонный электрод в разрез, сделанный в платформе губкой. И соедините коммерчески полученный наземный электрод с клеткой Фарадея.
Прикрепите записывающий электрод к держатель электрода и закрепите держатель к стереотаксисной руке микроманипулятора. Используя трехмиллиметровую пипетку Pasteur, перенасыщайте кончик губки электрода одной каплей раствора Ringer и располагайте микроскоп в клетке Фарадея над платформой электроретинограммы. Используйте кончик абсорбентной ткани, чтобы удалить излишки жидкости из кончика губки электрода и под микроскопом, располагайте активный электрод так, чтобы кончик губки мягко касался центральной поверхности роговицы личинородного глаза зебры.
Затем переместите чашу Ganzfeld к платформе губки, заботясь о том, чтобы личинка была покрыта чашей, и закройте клетку, чтобы уменьшить посторонний электромагнитный шум. Чувствительность личинки сетчатки зебры к тусклым вспышкам увеличивается с возрастом. Поскольку а-и b-волны не узнаваемы при интенсивности ниже минус 1,61 бревенчатой канделы на метр в квадрате на четыре дня после оплодотворения, в то время как четкие сигналы обнаруживаются при этих интенсивностях у старых личинок.
Амплитуда b-волны заметно увеличивается между четырьмя и пятью пост-оплодотворениями. В семь дней, сигнал на 2,48 бревенчатой канделы второй метр в квадрате больше по сравнению с днями пять и шесть после оплодотворения. A-и b-wave неявное время становятся значительно быстрее после пяти дней после оплодотворения.
В целом, эти результаты демонстрируют созревание функции сетчатки зебры между четырьмя-семью днями после оплодотворения. Для успешного выполнения этого протокола крайне важно, чтобы губки были полностью насыщены жидкостью, которая помогает поддерживать проводимость записывающего электрода и снижает уровень шума. Если а-волна представляет особый интерес, фармакологические методы лечения могут быть применены, чтобы блокировать b-волновой компонент, таким образом подвергая полной а-волны.
