Этот протокол генотипирования MLB значительно повысил наше понимание эпидемиологии и глобальной структуры популяции Yersinia ruckeri, международно важной патогенной бактерии рыбы. По сравнению с ранее установленными схемами ввода Yersinia ruckeri, он предлагает очень высокое разрешение напряжения. Процедура проста, дешева, и награды портативных результатов, которые можно легко сравнить в лабораториях.
Методика значительно улучшает диагностическую специфичность и позволяет отслеживать инфекцию. Например, теперь мы часто можем различать вирулентные клоны Yersinia ruckeri, существующие на фоне невирулентных экологических штаммов. Демонстрацией процедуры будет Сайма Насрин Мохаммад, техник в нашей лаборатории.
Для начала используйте стерильные петли прививки, чтобы посеять Yersinia ruckeri чистых культур на любой подходящий тип агара на чашках Петри. Инкубировать при 22 градусах по Цельсию в течение одного-двух дней или 15 градусов по Цельсию в течение трех-четырех дней. После этого, используя циклы прививки, выберите одну репрезентативную колонию из каждой чашки Петри и перенесите в 1,5-миллилитровые центрифуги трубы, содержащие 50 микролитров ультраочищенные воды для повторного использования.
Vortex кратко и инкубировать в течение семи минут на отопительный блок при 100 градусов по Цельсию. Затем центрифуга на 16 000 г в течение трех минут и использовать пипетку, чтобы тщательно передать супернатант шаблон ДНК в пустые 1,5-миллилитровые центрифуги труб. Перейти к следующему шагу или хранить ДНК на 20 градусов по Цельсию.
Для подготовки мастер-миксов сначала вычисляйте объемы реагентов в зависимости от количества анализируемых бактериальных образцов, также учитывая один отрицательный и один положительный контроль, и окончательный объем 10%излишков, как описано в рукописи. Обратите внимание, что используются различные концентрации грунтовки. В двух отдельных центрифуга труб, по одному на pcR анализ, добавить мультиплекс ПЦР плюс мастер смесь, грунтовки, и RNase свободной воды.
Vortex подготовленный мастер смешивает мягко на низкой скорости, а затем, распространять 22 микролитров каждого мастера смесь отдельно в отдельных скважин на либо ПЦР полосы или пластины. Затем добавьте три микролитров подготовленного шаблона ДНК к каждому хорошо содержащем мастер-микс;две скважины на образец бактерий, по одному для каждого анализа. Используйте ДНК из проверенного штамма Yersinia ruckeri для положительного контроля, и ультра очищенной воды для отрицательного контроля.
Печать и центрифуга кратко. Загрузите подготовленные реакции на термохитр ПЦР и навейте программу в соответствии с рукописью. Программа завершится менее чем за три часа.
В соответствии с рекомендациями производителя, добавить порошок агарозы гель в один раз буфер TBE для достижения 1,5 веса / объема процентов и тепла для растворения. Перед литьем охладите растворенного геля под проточной водой, добавьте 5 микролитров флуоресцентного нуклеиновой кислоты на 50 микролитров раствора геля и перемешайте. Соберите и выровнять литье лоток.
Добавьте конусы по мере необходимости для количества образцов. Налейте гель раствор в гипс и ждать, пока он затвердеет. После этого погрузите гипс, содержащий гель, в один раз буфер TBE в гелевую электрофорезную систему.
Смешайте пять микролитров продуктов ПЦР вместе с двумя микролитров погрузочного красителя в новые полоски ПЦР. Перенесите пять микролитров смесей в скважины в геле. Сохранить по крайней мере один хорошо пуст.
Добавьте пять микролитров лестницы ДНК в пустой колодец для справки. Подключите электроды и запустите гель на 110 вольт на 15 сантиметров в течение примерно одного часа. Используйте УФ-систему визуализации геля для проверки наличия нескольких полос, представляющих AMplicons КНР.
После подтверждения ПЦР-ампликонов используйте новые полоски ПЦР или пластины для разбавления продуктов ПЦР от одного до 10 в очищенной воде. Вихрь и центрифуга кратко. Во время работы в паровом шкафу, подготовить мастер смесь в центрифуге трубки, состоящей из формамида и эталонного размера стандартного решения.
По количеству анализируемых продуктов ПЦР используйте тома реагентов, как описано в рукописи. Разрешить 10%-ный объем. Vortex кратко и распространять 9,5 микролитров в отдельных скважин на ПЦР пластины подходит для доступной капиллярной системы электрофореза.
Затем добавьте 0,5 микролитров разбавленного ПЦР-продукта. Печать и центрифуга кратко. Затем загрузите пластину, содержащую образцы, в термохикер PCR и денатуратуруйте образцы при 95 градусах Цельсия в течение трех минут, прежде чем остыть до четырех градусов по Цельсию на неопределенный срок.
Центрифуга при 1000 г в течение одной минуты, тщательно удалите уплотнение и загрузите пластину на откалиброванную капиллярную электрофорезную систему в соответствии с инструкциями производителя. Вы запустите фрагмент анализа капиллярного электрофореза, используя реагенты, соответствующие аппарату выбора, и отрегулируйте условия ведения в соответствии с описанием в рукописи. Для Yersinia ruckeri VNTR капиллярный электрофорез размер вызова, первый импорт капиллярного электрофореза результат файлов в Gene Mapper 5 программного обеспечения.
Установите метод анализа, Microsatellite по умолчанию, выберите соответствующий выбор продукта в соответствии со стандартом размера, а затем нажмите кнопку анализа. С помощью редактора матча размера пройдите проверку правильной идентификации стандартных фрагментов размера и исправите любые явно ошибочные выделения. Затем выберите образец для чтения, нажмите кнопку Display Plot и нажмите Control A, чтобы можно было просмотреть таблицу размеров.
Находясь в верхней панели, удерживайте управление, нажимая на пять пиков, представляющих VNTR amplicons. Управление прессой G для фильтрации таблицы размеров, показывая только характеристики пяти выделенных пиков, и записывать размер вызовов для каждого локуса VNTR для приложения вниз по течению. Для учета предвзятых моделей подвижности ампликона во время капиллярного электрофореза вычислите точные отсчеты повторов VNTR, используя приобретенные вызовы размера в сочетании с конкретными переменными локуса.
Формула может быть реализована в шаблоне электронной таблицы для автоматизации. В электронной таблице круглое рассчитанное повторение VNRT отсчитывается до ближайшего центнера до анализа ниже по течению. В программном обеспечении BioNumerics создайте новую базу данных и хотите активировать плагин MLVA.
В панели типа эксперимента нажмите Создайте новый тип эксперимента, выберите тип символа и используйте настройки по умолчанию, когда их попросят. Затем выберите новый эксперимент и добавьте новые символы для каждого из 10 локусов VNTR, используя от нуля до 100 в качестве диапазона значений. Вернуться в основной панели, импорт Yersinia ruckeri VNTR повторных подсчетов и метод данных путем выбора импортных полей и символов.
Найдите файл, в котором он хранится, и сделайте выбор в столбце типа Destination. Для VNTRs это означает выбор соответствующего значения символа, в то время как различные метаданные классифицируются как поля входной информации. Сделанный выбор может храниться в качестве шаблона, чтобы облегчить процесс на более поздний этап.
Выберите импортированные образцы, предназначенные для анализа кластеров MST, а затем нажмите кнопку «Создать новую кнопку сравнения» в панели сравнения. При желании для визуального представления MST, выделить образцы для цветных групп, например, в соответствии с конкретной функцией метаданных. Затем выберите Расширенный кластерный анализ и MST для категоричных данных для создания диаграммы MST на основе выбранных образцов.
Далее измените визуальную презентацию MST, добавив параметры раздела, поперечные длины, маркировку ветви узла и т.д. При необходимости экспортировать завершенный MST в нужном формате с использованием выбора изображения экспорта. После мультиплекса PCR, гель электрофорез изображение проверяет наличие нескольких ампликонов во всех 12 полос, содержащих образцы, с первой полосой, представляющей лестницу ДНК используется.
В электроферограммах, полученных в результате капиллярного электрофореза, различные локусы VNTR можно определить в зависимости от сочетания размера и маркировки красителя. Оранжевые пики представляют собой используемый стандарт размера. Например, показан минимальный охватывающий дерево, основанный на профилях MLVA из изолятов Yersinia Ruckeri, извлеченных из атлантического лосося в пяти различных норвежских фермах.
Можно наблюдать четкую тенденцию кластеризации, связанную с происхождением фермы. Идентификация MLVA различных клонов Yersinia ruckeri, доминирующих, например, в частности географических регионах видов рыб, уже была использована для улучшения стратегий вакцинации против этого патогена.
