Cis-регулятивные элементы, такие как промоутеры и усилители, являются ключевыми детерминантами экспрессии генов. Традиционные подходы к изучению этих элементов являются трудоемкими и часто связаны с использованием гетерологических генов репортера. Здесь мы демонстрируем использование CRISPR для изучения транскрипционные роли RUNX1 intronic глушитель в линии клеток лейкемии.
Протокол прост в работе и позволяет быстро работать с функциями регулирования генов в эндогенном генном контексте. Гематопоэтические клетки часто трудно трансфицировать плазмидными методами. В этом протоколе мы используем электропорацию для доставки предварительно собранного Cas9, направляющий РНК, комплексы в клетки.
Преимущества этого подхода включают использование улучшенной эффективности редактирования и жизнеспособности клеток, а также снижение нецелеспособных эффектов. Кроме того, последующее использование фрагментного анализа позволяет просто и быстро высасыть нужных клонов-мутантов из большого количества образцов. Демонстрация процедуры будет Yuk-Lin Yung, техник для моей лаборатории.
Начните с разработки двух РНК CRISPR, одной из пяти основных и трех других основных целевых элементов cis-регулирования, или CRE. Убедитесь, что PAM NGG расположен непосредственно вниз по течению от целевой последовательности для распознавания Cas9. Чтобы сформировать комплекс гРНК, объединить РНК CRISPR и трассировщик РНК в буфере TE в соответствии с рукописными направлениями, для окончательной концентрации дуплекса 44 микромоляров.
Инкубировать смесь при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут и дать ей остыть до комнатной температуры. Разбавить рекомбинантную нуклеазу Cas9 с помощью PBS для окончательной концентрации нуклеазы 36 микромолей. Затем смешайте равный объем разбавленной нуклеазы с каждым из дуплексов гРНК и инкубировать их в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы позволить комплексу RNP сформироваться.
Центрифуга 2,5 миллиона клеток в 1,5 миллилитровой трубке в 500 раз г в течение пяти минут. Затем отбросьте супернатант и повторно приостановьте клетки в 163 микролитров RPMI 1640 среды без фенола красного цвета. Добавьте 16,7 микролитров комплекса RNP и 3,6 микролитера 100 микромоляторов электропорации усилителя к клеткам и перенесите смесь в 0,2-сантиметровый электропорный кювет, заботясь о том, чтобы не вводить пузырьки.
Электропорат клетки и передать их в Т-25 ткани культуры колбу, содержащую 6 миллилитров полного RPMI 1640 среды. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5%-диоксидом углерода. На следующий день после электропорации разбавляют клетки до 5000 клеток на миллилитр в полной среде RPMI 1640.
И добавить 100 микролитров клеточной суспензии в каждый колодец 96-хорошо пластины культуры тканей. Культура клеток в течение семи-14 дней, а затем извлечь геномную ДНК с помощью системы высокой пропускной способности очистки. Добавьте 100 микролитров связывания пластин и буфера лиза к каждой колодец 96-хорошой пластины экстракции, а затем 50 000 ячеек, повторно приостановленных в 10 микролитров PBS.
Смешайте содержимое хорошо, трубя вверх и вниз. Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы геномная ДНК была привязаться к скважинам. Затем тщательно аспирировать раствор из колодцев и промыть их 120 микролитров буфера мытья.
Воздух высушит тарелку. Добавьте 20 микролитров смеси ПЦР к каждому колодец и запустите ПЦР в соответствии с рукописными указаниями. После завершения усиления оцените количество продукта, измерив концентрацию выбранного количества образцов с помощью флюорометра.
Разбавить все образцы до 0,5 нанограмма на микролитер с нуклеазной свободной водой. Смешайте один микролитр разбавленного ПЦР-продукта с 8,5 микролитров деионизированного формамида и 0,5 микролитров флуоресцентного красителя, маркированных размером стандарта в 96-ну пластине, совместимой с генетическим анализатором. Обложка пластины с септа пластины и денатурации образцов при 95 градусов по Цельсию в течение трех минут в термоциклер.
Выполните капиллярный электрофорез, чтобы отделить маркируемые продукты ПЦР и проанализировать результаты анализа программного обеспечения. Проверьте оранжевый значок, чтобы просмотреть помеченные фрагменты и стандарт размера для оценки качества вызова размера. Затем проверьте синий значок, чтобы просмотреть маркированную продукцию PCR.
Определите пики, соответствующие продуктам дикого типа и мутантов, и оцените уровень мутантов в каждой выборке, разделив область под пик мутантов на сумму области под пиками дикого типа и мутантов. Выберите несколько пулов ячеей с высоким уровнем ожидаемых удалений для дальнейших серийных разбавлений. Повторите шаги ДНК-извлечения, флуоресцентного ПЦР и капиллярного электрофореза и выберите клонов с мутантными уровнями более 95% для последующего анализа.
Извлекайте полную РНК из выбранных клонов и выполняем бесплатный синтез ДНК. Смешайте РНК с поли-T грунтовки и dNTPs в соответствии с рукописными направлениями и инкубировать при 65 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Затем поместите реакцию на лед, по крайней мере одну минуту.
Добавьте десять микролитров смеси синтеза кДНК в реакцию. Затем инкубировать образец при 50 градусах по Цельсию в течение 50 минут и 85 градусов по Цельсию в течение пяти минут в термоциклере. После синтеза кДНК обработать образцы одним микролитером RNase H и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут.
Дизайн праймеров и TaqMan зондов специально для индивидуальной дисперсии стенограммы порожденных альтернативных промоутеров и клонировать фрагменты ДНК, содержащие конкретные последовательности стенограммы в плазмидной ДНК. Сделайте десятикратную серию разбавления рекомбинантных плазмидов в качестве стандартных кривых для количественной оценки стенограммы. Подготовьте 20 микролитров смеси ПЦР для каждого образца и запустите ПЦР в режиме реального времени в соответствии с рукописными указаниями.
Проанализируйте результаты и нормализует количество копий целевых стенограмм в каждом образце с геном домашнего хозяйства. Этот протокол был успешно использован для удаления RUNX1 intronic глушитель и удаление было подтверждено с капиллярного геля электрофорез. Ожидаемые размеры продуктов дикого типа и мутантов ПЦР составляет около 500 базовых пар и 230 базовых пар соответственно.
Размер продуктов-мутантов может варьироваться между клонами из-за иделей, образовавав их на участках расщепления. Для подтверждения личности удалений использовалось секвенирование Сэнгера. Ген RUNX1 содержит два промоутера, P1 и P2, которые произвели три основных транскрипта мРНК: RUNX1c P1, и RUNX1a и RUNX1b P2. Количественный ПЦР в режиме реального времени может быть использован для определения того, как удаление элемента глушиния влияет на выражение этих стенограмм.
Хороший дизайн РНК CRISPR имеет важное значение для его оценки эксперимента. Убедитесь, что РНК CRSIPR упакована близко к предполагаемой области удаления. Кроме того, убедитесь, что последовательность PAM расположена ниже по течению от целевой последовательности для распознавания Cas9.
Помимо изучения CREs, эта стратегия может быть использована для исследований расположения генов и служит альтернативой РНК-интерференции для изучения функций генов. Объединив с хромосомой конформации захвата методы CRISPR, безусловно, поможет расшифровать участие CREs в измененной организации генома и экспрессии генов, связанных с различными проблемами со здоровьем, как рак.
