Эта физиологически релевантная химерная модель спонтанных аутореактивных герминальных центров позволяет связывать клеточной локализации in vivo с молекулярными анализами ниже по течению. Основным преимуществом смешанной химерейной модели аутореактивных гермальных центров является ее универсальный и маргинальный характер, позволяющий допросить практически любой желаемый клеточный подмножество или молекулярный путь. Физиологическая актуальность этой модели развития аутоиммунных заболеваний позволяет новые идеи, которые могут помочь развитию новых методов лечения.
Эта модель химер костного мозга может быть использована в иммунологии, иммуноонкологии и исследованиях стволовых клеток. Компонент фотоактивации широко использовать, так как он связывает локализацию тканей с анализом клеток вниз по течению. Подготовка костного мозга и восстановление и виво маркировки и ткани эксплантации шаги все технически сложные процедуры, которые хорошо поддаются визуальных демонстраций.
Чтобы извлечь донора 564Igi мыши бедренной кости и голени, удалить кожу из одной задней конечности, и выскочить колена и голеностопного сустава, потянув на ногу силой. Продолжайте ломать голеностопный сустав. Затем потяните ногу к телу, держась за голени, тем самым лишая сухожилия и мышцы от голени.
Перерыв коленного сустава, чтобы освободить голени, и тянуть кости к телу, держась за бедренную кость, чтобы лишить сухожилий и мышц от бедренной кости. Затем сделайте разрез в тазобедренном суставе, и сократить сухожилия, прежде чем потянув бедренной кости из тазобедренного сустава. После удаления контралатеральных костей задних конечностей аналогичным образом, тщательно протрите кости грубым бумажным полотенцем, чтобы удалить оставшиеся мышцы и соединительной ткани, и промыть полосатые кости в ледяной буфер костного мозга.
Затем используйте Dumont номер семь типсов для передачи костей в контейнер свежего буфера костного мозга на льду. Для извлечения клеток костного мозга, промыть раствор в ледяной буфер костного мозга, и использовать 10-миллилитровый серологический пипетку, чтобы заменить буфер мытья с 10 миллилитров свежего, ледяного буфера костного мозга. Используйте типсы для передачи костей в ступку, и использовать пестик, чтобы раздавить и измельчить кости, чтобы освободить костный мозг.
Используйте 10-миллилитровую пипетку для сбора экстракта костного мозга перед передачей раствора костного мозга через 70-микрометровый клеточный ситечко в 50-миллилитровую коническую трубку на льду. Затем промойте раствор дополнительными 10 миллилитров свежего, ледяного буфера костного мозга, чтобы обеспечить полное восстановление клеток. Чтобы подготовить донорские суспензии, смешайте соответствующие объемы фотоактивируемого GFP и 564Igi донорского костного мозга в 50-миллилитровой конической трубке, и гранулы клеток центрифугации.
Перерасходовать гранулы смешанных клеток в концентрации от 1 раза 10 до восьми клеток на миллилитр ледяного костного мозга буфера, и передать клетки в предварительно обледенее, 1,5-миллилитровый микроцентрифуг трубки на льду. Далее, подтвердить отсутствие ответа на боль в крайнем случае в анестезии CD45.1 реципиент мыши, и Флик трубки донорских клеток костного мозга для обеспечения адекватного повторного успенения. Загрузите 200 микролитров смеси костного мозга в один 0,3-миллилитровый, 30-го калибра инсулиновый шприц, и, с получателем на его стороне, аккуратно растянуть кожу выше и ниже глаза, чтобы слегка выскочить глаз.
Аккуратно вставьте кончик шприца под приблизительным 30-градусным углом в переднюю часть глазницы, заботясь о том, чтобы избежать глаз и окружающих тканей. Когда кончик иглы касается кости, подмеской глазницы, втягивать иглу около 0,5 миллиметра, прежде чем использовать постоянное давление, чтобы медленно вводить донорский костный мозг. Затем верните мышь в клетку с помощью антибиотиков-либитумов, с мониторингом до полного выздоровления.
Чтобы обозначить поплитальный лимфатический узел, разбавить два микролитера фикоэритрона помечены крысы анти-мышь CD169 антитела в 18 микролитров PBS, и добавить два 10-микролитровых капель антитела на кусок пластиковой парафиновой пленки. Загрузите каждую каплю в один 0,3-миллилитровый инсулиновый шприц с помощью иглы 30-го калибра и ввелите 10 микролитров антител в подножку обезболивающего животного-реципиента. Перед сбором лимфатических узлов, поместите квадратный крышку на плоскую поверхность, и использовать вакуумный смазки загружены, пять миллилитров шприц, чтобы проследить края крышки с жиром около одного-двух миллиметров от каждого края.
Перенесите камеру на холодную плоскую поверхность и заполните вакуумную камеру смазки ледяным буфером костного мозга. Чтобы получить доступ к popliteal лимфатических узлов, используйте прямые, тонкие ножницы, чтобы сделать разрез в коже чуть ниже колена яму усыпляемого животного-получателя, и продлить разрез вверх вдоль подколенного сухожилия линии почти до тазобедренного сустава. Используя Dumont номер пять или номер семь типсов, вытащить каждый из открытых лоскутов кожи наружу, чтобы разоблачить ткани в popliteal fossa, и использовать типсы, чтобы тщательно войти в яссу просто медиальной к popliteal вены.
Откройте и закройте щипцы вдоль оси ноги подвергать основной popliteal лимфатический узел перед использованием большого пальца и указательного пальца, чтобы ущипнуть четырехглавой мышцы с передней стороны проксимальной до колена, чтобы поп лимфатический узел из ямы. Сдвиньте типсы под лимфатическим узлом, чтобы освободить узел от окружающих тканей и поместите его в вакуумную камеру смазки. После того, как второй лимфатический узел был собран, поместите вторую крышку на обод вакуумной смазки, и нажмите вниз осторожно, чтобы закрыть камеру, заботясь, чтобы выдавить все пузырьки воздуха.
Чтобы определить зародышевые центры в образцах тканей селезенки, поместите камеру визуализации на стадию двух фотон флуоресцентного микроскопа и используйте 3,5-миллилитровую пластиковую трубчатую трубу для размещения капли дистиллированной воды поверх верхней крышки. Опустите цель до точки соприкосновения и используйте передаваемый свет, чтобы сосредоточиться на верхней части ткани. Переключитесь на темный режим и двухкордовое возбуждение, а также настройте лазер на 940 нанометров.
Найдите отдельные бело-пульпные области, граничащих с Окрашиванием CD169 вблизи поверхности ткани, и определите периартириолярную лимфоидную оболочку вторым поколением гармоник, связанным с центральным артериолом. В зоне между периартериолярной лимфоидной оболочкой и маргинальной зоной, определить наличие высоко аутофторесцентных, активированных макрофагов стенцом тела и, используя эти ориентиры, нарисовать область интереса вокруг одного зародышевой центральной области. Затем установите стопку глубиной от 100 до 150 микрометров, начиная с поверхности ткани и используя шаг размером около трех микрометров, прежде чем перейти на 830-нанометровую восклицательный длину волны.
Выключите или потускнюйте все каналы, чтобы предотвратить фотопамейдж для детекторов, и изображение стека. Затем переключитесь на длину волны 940-нанометрового возбуждения и вновь открыв каналы, сканируя стек, чтобы подтвердить эффективную фотоактивацию и отсутствие фотодемейства по всему стеку изображения. Серотипирование смешанных химер костного мозга показывает нормализованные номера В-клеток в течение шести недель после восстановления, с низкой частотой 9D11-положительных циркулирующих В-клеток, полученных из отсека 564Igi.
В общей лимфоцитов ворота, была низкая частота остаточного получателя полученных клеток, около 6% из которых CD45.1-производных, что свидетельствует об общей степени химеризма около 94%Был практически полный химеризм в отсеке B клеток и доминирование фотоактивируемых GFP костного мозга полученных В-клеток, следствием тяжелого отрицательного отбора 564Igi-производных клеток. Как было отмечено, маркировка in vivo CD169 способствует надежной визуализации маргинальной зоны. Второй сигнал гармоник проявляется в коллагенсодержащих структурных элементов и основных сосудов, в том числе центральный артериол периартериолярной лимфоидной оболочки и высоко аутофторесцентные, активированные макрофаги с покалывания тела, связанные с активностью зародышевых центров.
В совокупности эти данные позволяют идентифицировать область интереса, которая, вероятно, содержит единый, фотоактивируемый зародышевой центр. Цитометрическая оценка потока вниз по течению еще раз подтверждает наличие нормализованных номеров В-клеточного отсека, спонтанной зародышевой центральной популяции и подмножества фотоактивированных зародышевых клеток центра В. Важно ограничить общее время оборота эксплантации, фотоактивации и обработки тканей шагами до четырех-шести часов, чтобы обеспечить достаточную жизнеспособность клеток.
Фотоактивированные клетки могут быть отсортированы по течению и подвергнуты одноклеточному секвенированию, чтобы, например, охарактеризовать репертуар В-клеточных рецепторов одного зародышевого центра. Смешанная химера модель позволила исследования аутореактивных зародышевой биологии центра на новой глубине, например, обеспечивая понимание того, как процесс распространения эпитопа разворачивается. Обратите внимание, что источником света для двухкороновой микроскопии являются очень мощные импульсные лазеры класса 4, которые могут серьезно повредить глаза.
