Этот метод растворимизации рекомбинантного шелка паука производит материальные формы, которые невозможны с использованием традиционных суровых органических растворителей. Далее, процесс зерна, в результате чего простой раствор белка в воде. Используя этот метод, материалы, сформированные или произведенные, сохраняют желаемые характеристики белков шелка паука.
Этот метод solubilization для рекомбинантного шелка паука позволяет solubilization рекомбинантного шелка паука в одном шаге процесса. Это желательно, потому что эти заведомо трудно производить белки не теряются в результате обширной обработки. Кроме того, поскольку растворы просто белка в воде, другие биологически активные соединения могут быть добавлены, если это желательно для применения.
В частности, белковая структура функции отношения, эта система является мемическим, как паук делает волокна в том, что он использует воду и белки в высокой концентрации. Используя этот метод solubilization и последующего материального образования, она должна быть возможность получить понимание в материалы, которые формируются, и структуры, которые отвечают за них. Считается, что это может быть, мы использовали этот метод для solubilizing синтетических пептидов, которые в противном случае потребует щелочной или кислой среде, чтобы solvate.
Это может быть выгодно в нижнем течении приложений для этих пептидов. Кроме того, ряд известных белков, выраженных синтетически, как правило, в конечном итоге в нерастворимой фракции. Повторное висяние, а затем повторное сбавляние этих белков часто является трудоемким процессом, который приводит к большим потерям.
Используя этот метод, можно было бы повысить эффективность процессов восстановления нерастворимых белков. Размещение запечатанного флакона в микроволновой печи немного сложной давая риск перегрева и, таким образом, над давлением флакона. Понимание поэтапного подхода к применению тепла и давления имеет решающее значение.
Во-вторых, для рекомбинантного паука шелка, в частности, наличие соли настоящее не позволит технике работать или работать так же эффективно в зависимости от того, сколько соли присутствует. Удаление соли является ключевым фактором. Будьте терпеливы и осторожны, внимательно следите за временем микроволновой печи и температурами внутри флакона.
Это имеет решающее значение, поскольку существует ряд движущихся частей для работы, которые часто трудно передать через традиционные письменные материалы и разделы методов. Учитывая, что Есть много белков, которые имеют проблемы с solubility, которые препятствуют адекватному изучению, этот метод имеет потенциал для применения в различных белковых пространствах, чтобы улучшить, или даже позволяют аналитические методы и характеристики. Для начала выберите чистый и новый восьмими миллилитр автоклавный борозиликатный стеклянный флакон культуры с резиновой облицованной винтовой крышкой, и поместите пустой флакон на аналитический баланс.
Разорвьте массу пустого флакона так, чтобы баланс считывает нулевую массу. Добавьте желаемый лиофилизированный рекомбинантный порошок шелкового белка паука в пустой флакон для конкретного материала. Затем добавьте нужное количество ультра чистой воды, по крайней мере два миллилитров, в флакон.
Печать флакон крышка, и быстро вихрь содержимое для создания рассеянного и однородного рекомбинантного паука шелковой белковой смеси. Выполните окончательную проверку флакона крышки, чтобы убедиться, что он был твердо и надежно ужесточены. Затем перенесите подвешенную рекомбинантную смесь белка паука в обычную микроволновую печь мощностью от 700 до 1500 Вт.
Начните работу микроволновой печи с пяти вторых очередей установить полную мощность, вручную включение и выключение. После каждого взрыва, кратко откройте дверь, и тщательно перемешать флакон, чтобы предотвратить урегулирование, и поддерживать приостановлено смеси. Иногда дайте флакону и раствору остыть, и предотвратить перегрев раствор от прикосновения к уплотнению.
Используйте инфракрасный термометр для измерения температуры раствора, содержащего часть флакона. Повторите микроволновый процесс до тех пор, пока температура не достигнет по крайней мере 130 градусов по Цельсию, и все твердые частицы были полностью растворены. Затем дайте температуре раствора и крышке флакона остыть ниже 100 градусов по Цельсию.
До полного охлаждения раствора отбросив его из флакона в конкретные геометрии, чтобы сформировать гидрогель. После образования гидрогеля поместите его в водяную баню и перенесите в морозильную камеру при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Подождите, пока ванна полностью замерзла.
Завершите процесс образования губки, удалив замороженный гидрогель и водяную ванну из морозильной камеры и оттаив при 25 градусах Цельсия. Затем удалите полученную губку из талой воды. Чтобы подготовить лиогель, перенесите замороженный образец гидрогеля лиофилизатору.
Через 24 часа снимите с сосуда последний лиофилизированный гель-материал. Для производства пленок рекомбинантного белка шелка паука, отлиты 200 микролитров горячего солубилизированного рекомбинантного белка шелка паука из флакона на форму PDMS желаемой формы. После того, как он высохнет, снимите его с субстрата PDMS для тестирования или лечения.
Чтобы подготовить покрытие, которое не может быть удалено из субстрата, используйте опрыскиватель аэрографа, чтобы применить солубилизированный рекомбинантный белок шелка паука для выполнения первоначального покрытия спрей на субстрате выбора. После того, как он высохнет, погрузите покрытый субстрат в солубилизированный рекомбинантный белок паука шелка, чтобы сформировать покрытие для погружения. Повторите покрытие погружения для достижения желаемой толщины.
Чтобы сформировать клей, используйте пипетку, чтобы добавить растворимый рекомбинантный белок шелка паука на субстрат, а затем применить второй субстрат поверх раствора. Твердо зажимать куски вместе, а затем высушить образцы в духовке с минимальной температурой 25 градусов по Цельсию, по крайней мере 16 часов. Для генерации влажных закрученных волокон используйте 19 калибровочную скользящую иглу и загрузите раствор раствора для допинга в концентрический шприц с наконечником замка Luer.
Выброс пузырьков воздуха, и пусть допинг сидеть на Luer замок конце шприца. Вставьте по крайней мере 25 миллиметров труб PEEK в одной части пальца PEEK в жесткой фитинги для одного более 16 дюймов внешнего диаметра, и 10 более 32 гребень. Замените 19 калибровочных игл с этой установкой на luer блокировки женский адаптер шприца.
Затем поместите нитриловые перчатки на внешней стороне промежуточных крестителей, чтобы сохранить волокно, которое будет генерироваться от скольжения, и, чтобы избежать повреждения двигателей. Получить высокий ясный стеклянная ванна с 99%чистый изопропанол для использования в качестве ванны коагуляции. Заполните первый участок ванны с 80 до 20 соотношение изопропанола и дистиллированной воды.
Во втором участке ванны, заполнить от 20 до 80 соотношение изопропанола и дистиллированной воды. Навеяте систему растяжения крестного растяжек на компьютере. Чтобы отрегулировать основную скорость удаления волокна, отрегулируйте раздвижную планку для godet triplet A скорость до значения от 10 до 14 миллиметров в секунду, в зависимости от того, насколько хорошо и быстро образуется волокно.
Инициировать первый стрейч, перемещая раздвижные бар крестного тройного B стрейч соотношение к двум Для окончательного godet в стрейч ванны один, средний верхний крест, и первый крест в стрейч ванны два. Инициировать второй участок, перемещая раздвижные бар крестного тройного C стрейч соотношение к двум для окончательного godet в стрейч ванны два, последний верхний крест, и обветка. Эта установка гарантирует, что первый godet после ванны коагуляции, и первый godet в первой ванне стрейч вращаются с той же скоростью.
Затем загрузите шелковый раствор в шприц пользовательского инструмента линии спина. В автоматизированной системе установите скорость экструзии до 10 миллиметров в секунду, чтобы выдавить шелковый раствор в стеклянную коагуляционную ванну, наполненную изопропанолом. Разрешить экструзии волокна, чтобы стать равномерной, прежде чем потянув волокна из ванны с тонким металлическим крючком.
Убедитесь, что удаление волокна из ванны создает петлю между наконечником труб PEEK и путем волокна, покидая ванну. Руководство извлеченных волокна через ряд крестет, так что волокно погружается в стрейч ванны, но сушки в воздухе между стрейч ванны, и перед переходом на катушку. В этом протоколе путем solubilization рекомбинантного протеина шелка паука, разнообразие материальных форм можно достигнуть.
Здесь представлено семь материальных форм. Гидрогель, лиогели, губка, клеи, покрытия, пленки и волокна. Волокна требуют самой обширной обработки путем экструдирования в ванну коагуляции, а затем последовательно растяжения сырья волокна в пост бен стрейч ванны.
Учитывая, что белковые и водные растворы нагреваются до относительно высокой температуры и давления, наш опыт показывает, что растворы стерильны в момент, когда белок разрешается. Это позволяет любой из представленных здесь материальных форм быть приняты к клеточной культуре, до тех пор, как они обрабатываются надлежащим образом, для изучения клеточной реакции на материалы. Конечно, эта техника привела к открытию новых форм материала, в том числе клеев и губчатого материала.
Материальные формы, которые не обязательно ориентированы на образование волокон, хотя образование волокон является одной из областей, которые также видели улучшение за счет развития этой техники. Генерация тепла и давления внутри герметичного флакона имеет неотъемлемую опасность. Всегда носите средства индивидуальной защиты при выполнении этих процедур.
