Представленные здесь методы позволяют изучить молекулярные механизмы миграции иммунных клеток через мозговые барьеры при экспериментальном аутоиммунного энцефаломиелите, животной модели рассеянного склероза. Исследуя проницаемость гемоволо-мозгового барьера и матрично-металлопротезную активность в то же время в пространственной корреляции с инфильтрацией иммунных клеток в секциях тканей мозга, мы можем точно связать эти нейровоспламеняемые явления с клиническими признаками ЕАЭ. Профессиональная обработка больных мышей требует углубленного обучения, а также правильного подсчета клинических признаков ЕАО.
Таким образом, визуальная демонстрация выгодна. Начните эту процедуру с анестезии мышей C57-Black/6, которые были размещены в условиях, свободных от конкретных патогенов, как описано в текстовом протоколе. Исправить анестезированной мыши в одной руке, и ввести 30 микролитров пептида MOG и завершить адъювантной эмульсии Фрейнда подкожно в каждом из задних флангов ноги, в непосредственной близости от паховой лимфатических узлов.
Теперь поместите мышь на живот и ввимит 20 микролитров эмульсии MOG-пептида в мягкую жировую ткань как слева, так и справа от корня хвоста. Кроме того, ввиснуть немного капли эмульсии в шею мыши. Введать 100 микролитров коклюша токсина раствор интраперитонально в мышь.
Держите голову мыши ниже центра тела, чтобы избежать инъекций в кишечник. Замените диетпитание обслуживания к разводя диетпитании для того чтобы обеспечить мышей с едой более высокого содержания энергии перед и во время ожидаемого клинического заболевания. Повторите инъекцию коклюша через 48 часов после первого лечения.
Проверяйте состояние здоровья мышей EAE каждое утро, заглянув внутрь клеток. Оценка EAE мышей каждый день. Вынюйте из клетки каждую индивидуальную мышь, включенную в эксперимент EAE, и проверьте, есть ли у хвоста тонус.
Перемести хвост вверх пальцем. Здоровая мышь будет держать свой хвост вверх. Если клиническая ЕАЕ началась, хвост тонус будет ниже, видимый постепенным падением хвоста.
В конце концов, мышь не сможет поднять хвост на всех. Поместите каждую индивидуальную мышь, включенную в эксперимент EAE, на чистую скамейку, чтобы наблюдать и документировать поведение ходьбы. Смотрите текст для скоринга критериев для оценки тяжести заболевания, который является оценка ЕАО.
Оцените и документируйте вес каждой мыши, включенной в эксперимент. Для подготовки растворов акций декстрана растворите 10 миллиграммов трехкилотонного Dextran Texas Red в 500 микролитров раствора хлорида натрия 0,9% и пять миллиграммов 10-килодальтона Dextran Alexa Fluor 488 в 250 микролитров 0,9% раствора хлорида натрия. Для декстрана рабочий раствор, непосредственно перед инъекцией, пипетка 55 микролитров 10-килодальтон Dextran Alexa Fluor 488 фондовый раствор на кусок герметизации пленки.
Затем добавьте 55 микролитров трехкилотонного раствора Dextran Texas Red. Смешайте и соберите 100 микролитров в одноразовый тонкий шприц. Затем поместите обезболивающее мышь в боковое положение на столе.
Внутривенно введать 100 микролитров флуоресцентных трассировщиков в мышь, прежде чем мышь просыпается. Пусть трассировщик циркулирует в течение 15 минут перед выполнением перфузии мышей, как описано в текстовом протоколе. Заполните плоский двойный контейнер с измельченным сухим льдом и добавьте 2-метилбутан до тех пор, пока жидкость не достигнет примерно одного сантиметра над сухим пакетом со льдом.
Накройте свободной крышкой, например, крышкой для ведра со льдом. После отсечения головы настоянной мыши острыми ножницами, удалите кожу и уши с помощью меньшего набора ножниц. Тщательно вскрыть тюбетейку, вырезая из foramen magnum к передней и правой стороне, чтобы позволить upfolding тюбетейки над мозгом.
Затем осторожно вывихнуть нетронутый мозг из основания черепа, разъединив оптические нервы с помощью плоского металлического шпателя. Поместите мозг на алюминиевую фольгу. Разрежьте мозг на три части, поместив два корональных разреза.
Три части представляют лобной мозг, средний мозг и мозжечок со стеблем мозга. Заполните Cryomold в первом квартале с оптимальной температурой резки матрицы. Затем поместите ломтики мозга в Cryomold, с передней стороны каждого мозга кусок лицом вниз.
Обложка ткани полностью с матрицей. Поместите Cryomold с тканью в горизонтальной ориентации в 2-метилбутановой ванне. Убедитесь, что ткань замерзает снизу вверх в течение одной минуты, избегая погружения всего блока ткани в ванну.
Перенесите замороженную ткань на хранение до минус 80 градусов по Цельсию. Смотрите текстовый протокол для подготовки замороженных секций тканей. Извлекать шесть микрон, не фиксированных секций тканей мозга, которые были подготовлены из EAE мышей.
В дымовой капот, оттепель разделы внутри пластиковой замерзающей коробке, содержащей кремнезем гель в крышке, чтобы избежать удержания воды в ткани. Раздельте две секции тканей на одном слайде, рисуя линии водоотталкивающей ручкой. Центрифуга реакционной растворов в течение пяти минут при 13, 300 раз г при комнатной температуре, и предварительно тепло до 37 градусов по Цельсию с помощью водяной ванны.
Затем регидратировать секции тканей в течение пяти минут при 37 градусах по Цельсию с помощью буфера реакции 1X. Через пять минут слейте буфер реакции 1X. Добавить раствор реакции на секциях тканей и инкубировать в течение четырех часов при 37 градусах по Цельсию.
Затем промойте горки пять раз в двойной дистиллированной воде. Теперь, исправить разделы в течение пяти минут с ледяным метанолом при температуре минус 20 градусов по Цельсию, прежде чем мыть их один раз с PBS при комнатной температуре. Добавить 1%BSA в PBS в раздел, и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре.
Затем отбросьте буфер из раздела, перевернут слайд на салфетку. Добавить основной коктейль антитела к разделу, и инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре. После мытья секций дважды с PBS, добавить вторичные антитела коктейль, и инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре.
Затем дважды промыть секции с помощью PBS и смонтировать слайды с встраиваемым раствором. После того, как установленные секции высохнут на ночь при комнатной температуре, проанализируйте секции окрашенных тканей с помощью флуоресцентного микроскопа. Тяжесть заболевания ЕАЭ увеличивается до пика заболевания, который можно ожидать между днями 16 и 20 после индукции ЕАЭ.
На пике клинического ЕАЕ мыши также показали самую низкую массу тела, что увеличивает корреляцию с повышением ЕАО в фазе ремиссии заболевания. Здесь показана репрезентативная картина хороидного сплетения и прилегающей к нему паренхимы мозга мыши C57-Black/6, страдающей от ЕАЕ. Мышь вводили внутривенно за 15 минут до того, как она пожертвовала.
Трассировщики легко рассеиваются по фенестированным микровесселям в стому хороидного сплетения, в то время как гемовоэнцефалический барьер не позволяет диффузии циркулирующих трассировщиков в паренхиму мозга, которая, таким образом, лишена любого флуоресцентного сигнала. На этих снимках показаны репрезентативные вытекающие кровеносные сосуды в мозжечках мыши C57-Black/6, страдающей от ЕАЭ. Наконечники стрел указывают на то, что трассировщики рассеиваются по микровесселям мозга в паренхиму ЦНС, что свидетельствует о нарушении функции геммоэнцефалический барьер в этих сосудах.
В паренхиме ЦНС зеленый и красный флуоресцентный сигнал виден за пределами стенок кровеносных сосудов. Правильное подкожное размещение эмульсии MOG-CFA имеет важное значение для установки соответствующего иммунного ответа, ведущего к EAE. Следует избегать внутриперитонеальной и внутримышечной инъекций.
Подготовка CFA под капотом дыма, чтобы избежать вдыхания attenuated Mycobacterium. Кроме того, избегайте самостоятельной инъекции с эмульсией MOG-CFA, так как это может привести к кондиломе или даже привести к EAE у людей, которые генетически предрасположены. Мозг-инфильтрации иммунных клеток могут быть изолированы от ЦНС мышей, страдающих от ЕАЭС для количественного проникновения подмножества иммунных клеток во время нейровоспламенения потоком цитометрии.
Оценка целостности эндотелиальных и глиальных барьеров мозга может быть переведена на анализ генетически модифицированных моделей мышей или на модели других неврологических расстройств.
