Наш протокол предусматривает как виво, так и ex vivo меры для визуализации и характеристики гиалоидной сосудов в глазу в качестве полезной экспериментальной модели для изучения сосудистой регрессии. Этот метод сочетает в себе как в vivo продольное наблюдение гиалоидных сосудов у живых мышей и ex vivo визуализации и точной количественной оценки вскрыли целые гиалоидные сосуды. Наша методика обеспечивает практический и осуществимый метод изучения патогенеза и основных механизмов стойких сосудов плода.
Этот метод также дает представление о клеточных и молекулярных механизмах, участвующих в регуляции регрессии глазных сосудов, которые могут иметь отношение к исследованиям ангиогенеза в других органах. Шаги гиалоидной изоляции могут быть технически сложными для начинающих. Много практики и терпения поможет обеспечить успешное вскрытие.
Визуализация этого метода обеспечит подробную практическую информацию и советы о технике, которые могут помочь зрителям в освоении навыков более эффективно. Для оптической слаженности томографии или OCT изображения, настроить мышь и зонд так, что оптическая головка нерва находится в центре поля зрения в fundus изображения и настроить фокус и угол указанной линии в программное обеспечение для визуализации OCT выявить стойкие гиалоидных сосудов до получения изображений. Для fundus флуорессейн ангиографии изображений гиалоидных сосудов, настроить выравнивание немного позиционировать голову зрительного нерва в центре поля зрения и изменить фильтр микроскопа на зеленый флуоресцентный канал.
Затем сосредоточьтесь на стойких гиалоидных сосудах и получите несколько изображений в один, три, пять и 10 минут после предпосылки, чтобы определить лучшую точку времени для соотношения сигнала к фону для наблюдения за сосудами. Для вскрытия и визуализации бывших виво-гиалоидных сосудов и визуализации используйте микрохирургию мипсы, чтобы открыть веки послеродовой мыши в восемь дней и поместить изогнутые микрохирургии миппы под глобус на орбите одного глаза, чтобы схватить зрительный нерв, не сжимая глазного яблока. Аккуратно потяните и удалите глазное яблоко с помощью типсов и зафиксировать глаз в 4%paraformaldehyde при комнатной температуре.
Через 30 минут перенесите фиксированные глазные яблоки на ледяной PBS под микроскопом вскрытия и ввелит 50 микролитров желатина раствора в стекловидное тело глазного яблока на четырех различных равномерно размеченных участках вокруг лимбуса. Затем инкубировать глазное яблоко на льду в течение 30 минут, чтобы укрепить вводили желатин в стекловидном пространстве. Когда желатин вылечился передачи глазного яблока в чашку Петри PBS под рассечением микроскопа и использовать микрохирургии ножницы, чтобы сделать разрез на лимбус, чтобы удалить роговицу.
Snip и удалить зрительный нерв под рассечением микроскопа. Используя две пары типсов отслаиваются и отбрасывают слои эпителия склеры, хороида и пигмента сетчатки, за которыми следует удаление радужной оболочки глаза. С зрительной нервной стороны сетчатки лицом вверх и линзы лицом вниз, вводить 50 микролитров PBS чуть ниже чашки сетчатки, чтобы накопление PBS между желатинизированных стекловидного тела и сетчатки.
Используйте микрохирургии миппы, чтобы аккуратно очистить чашку сетчатки и цилиарного тела от стекловидного тела. Используя передачу пипетки передачи желатин чашку, содержащую гиалоидной ткани погружается в PBS на слайд микроскопа. И переверни оставшиеся ткани так, чтобы объектив был обращен вверх.
Затем поднимите объектив и осторожно ослабить связь между объективом tunica vasculosa lentis и vasa hyaloidea propria перед резки гиалоидной артерии с ножницами микрохирургии, чтобы удалить объектив туника vasculosa lentis. Держите васа hyaloidea проприя области гиалоидной чашки для плоской крепления. Для плоского монтажа образцов гиалоидного сосуда аккуратно промойте гиалоидную чашку свежим PBS, чтобы удалить любые вскрытия мусора.
С тканью плавающей в PBS использовать микрохирургии типсов мягко организовать и настроить положение желатинизированной гиалоидной чашки так, что край чашки обращен вниз. Поместите слайд с гиалоидной чашкой, погруженной в PBS, на слайд теплее при 37 градусах по Цельсию. После того, как желатин тает и гиалоид выравнивается удалить слайд, когда он едва сухой и добавить каплю анти-увядание монтажной среды с DAPI, чтобы испачкать ядра в гиалоидных сосудов.
Затем аккуратно поместите крышку на гиалоид, чтобы завершить плоское крепление. Для изображения окрашивания DAPI гиалоидных сосудов перенесите установленный образец на стадию флуоресцентного микроскопа и подтвердите, что видна центральная гиалоидная артерия. Затем определите ветви сосуда, непосредственно полученные из гиалоидной артерии, и вручную подсчитайте количество ветвей сосудов для количественной оценки.
Здесь показаны поперечные виды oct изображений для сетчатки и гиалоидных тканей в трехмесячном диком типе и липопротеиновых рецепторах низкой плотности, связанных с белком пять или LRP5 нокаутом мышей, животной модели с стойкими гиалоидными сосудами. В этих флюоресцентных ангиографиях фондов наблюдается восемь ветвей гиалоидных сосудов в стекловидном теле шестинедельных нокаут-мышей, в то время как у диких животных того же возраста не наблюдается остатков гиалоидных сосудов. В этих гиалоидных сосудов плоские монтирует сосудистые клетки и связанные с ними макрофаги могут быть определены их ядерного окрашивания DAPI.
И каждая линия клеток, ветвяхся от центральной гиалоидной артерии представляет собой один сосуд вазы hyaloidea propria. Дикие мыши типа имеют в среднем 12 ветвей гиалоидных сосудов в послеродовой день восемь, в то время как возрастные LRP5 нокаут щенков экспонат около 25 ветвей гиалоидных сосудов, демонстрирующих значительно нарушенной регрессии гиалоидной сосудов. Кроме того, задержки и неполное развитие сосудов сетчатки также наблюдается у LRP5 нокаут щенков.
Действительно, гиалоидные сосуды все еще могут быть определены в поперечных сечениях LRP5 нокаутом секций глазной ткани в послеродовой день восемь. В то время как глаза дикого типа больше не отображают эти сосуды. Самое главное помнить, чтобы быть нежным и терпеливым при изоляции гиалоидной системы от сетчатки и других глазных тканей.
После изоляции гиалоидных сосудов иммуностимулирование с различными клеточными маркерами может быть выполнена, чтобы раскрыть клеточные взаимодействия, регулирующие регрессию гиалоидов. Этот метод исследует основные клеточные и молекулярные механизмы стойких сосудов плода в исследованиях глазного ангиогенеза. Параформальдегид, кетамин и ксилазин опасны.
Пожалуйста, подготовьте эти реагенты в химическом дымовом капоте с использованием надлежащего средства индивидуальной защиты.
