Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области гипертонии и сердечно-сосудистых заболеваний, включая изучение CD11c положительных дендритных клеток и как они потенции роль гипертонической травмы. Основным преимуществом этого метода является изоляция положительных дендритных клеток CD11c от твердых органов и изучение их физиологической роли в различных состояниях заболеваний. Таким образом, этот процесс может быть применен к нескольким типам иммунных клеток, включая В-лимфоциты, Т-лимфоциты, моноциты и макрофаги.
Визуализация метода имеет решающее значение для понимания дендритической изоляции клеток, в частности, процесс передачи в реципиент мышей. Для начала распылите грудь и бока усыпанной мыши 70%этанолом. С левой стороны, тщательно откройте кожу и брюшной полости подвергать селезенки.
Используя небольшие типсы, осторожно переместите кишечник и печень на левую сторону мыши. Затем используйте маленькие ножницы, чтобы аккуратно вырезать селезенку. Поместите каждую вырезанную селезенку в помеченную трубку C, содержащую три миллилитров rpMI 1640 среды.
Сначала добавьте коллагеназу D и DNase, чтобы подготовить RPMI 1640 среды для подготовки раствора пищеварения селезенки. Поместите трубку C на полуавтоматический гомогенизатор и убедитесь, что трубка плотно расположена на вращающейся руке. Нажмите кнопку "Пуск" на гомогенизаторе, чтобы запустить протокол селезенки 04.01 в течение 60 секунд.
После этого отсоедините трубку от гомогенизатора и инкубировать образцы при 37 градусах Цельсия при непрерывном при 20 об/мин в течение 15 минут. Затем используйте пипетку для переноса раствора в 50-миллилитровую коническую трубку после фильтрации через 40-метровый ситечко. Вымойте ситечко с 10 миллилитров dPBS.
Центрифуга клетки в 300 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Затем аспирировать супернатант полностью и мыть гранулы, повторно приостановив его в 10 миллилитров dPBS. Центрифуга подвески в 300 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Повторно приостанавливайте гранулы ячейки в пяти миллилитров dPBS. Используйте гемоцитометр и trypan синий исключение для подсчета количества клеток. Следующая центрифуга при 300 раз g и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы гранулировать клетки.
Аспирировать супернатант полностью и повторно приостановить гранулы в 400 миллилитров магнитно активированной ячейки сортировки буфера. Затем добавьте 100 миллилитров микроволокна CD11c на 100 миллионов клеток. Вихрь клеточной подвески и инкубировать в течение 10 минут в холодильнике при четырех градусах по Цельсию.
После этого добавьте 10 миллилитров буфера MACs для мытья клеток и центрифуг при 300 раз g и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Аспирировать супернатант полностью и повторно приостановить клетки в 500 миллилитров буфера MACs. Поместите колонку LS в магнитное поле магнитного сепаратора и поместите 15 миллилитровую коническую трубку под каждую колонку, чтобы собрать поток до конца.
Затем смойте колонны тремя миллилитров буфера. Поместите подвеску ячейки на каждую колонку и соберите поток, через который содержатся неоцеличные ячейки. Вымойте столбцы с тремя миллилитров буфера MACs и собирать неоцеличные клетки, которые проходят через.
Вымойте столбцы LS два раза, используя три миллилитров буфера MACs за стирку. После этого удалите столбцы LS из магнитного сепаратора. Добавьте пять миллилитров буфера MACs к каждой колонке и немедленно окуните каждую колонку в четкую 15 миллилитровую коническую трубку, чтобы избавиться от магнитно помеченных ячеек.
Используйте гемоцитометр и trypan синий исключение для определения CD11c положительный номер постоянного тока, как указано в текстовом протоколе. Затем разбавить образец клетки при разбавлении один к одному в 0,4%Trypan синий раствор. Во-первых, подготовить ячейки гранулы в DC культуры средств массовой информации, как указано в текстовом протоколе.
Pipette 900 микролитров подвески DC в 24-хорошо плоский нижней сокол пластины. Добавьте 100 микролитров высокосоленых СРЕДСТВ массовой информации культуры DC к каждой хорошо, для окончательной концентрации натрия 190 миллимоляров. Этикетка пластины и поместить его в увлажненной инкубатор двуокиси углерода при 37 градусов по Цельсию в течение 48 часов.
Через 48 часов снимите тарелку с инкубатора. Pipette ячейки культуры средств массовой информации в одном хорошо вверх и вниз, чтобы вновь приостановить CD11c положительные DCs. Передача все это приостановление в соответствующей помечены 1,6 миллилитров трубки.
Повторите это для каждого человека хорошо, что было помойять. Центрифуга все трубки при 300 раз g и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Аспирировать супернатант и повторно приостановить гранулы DC с 100 микролитров стерильных dPBS.
Затем нарисуйте раствор постоянного тока из одной из трубок в одномиллилитровый шприц, оснащенный 27-дюймовой иголкой. Поместите наивный мужчина 10 недель C57-черный-6 мыши под 2%isoflurane для достижения стабильной хирургической плоскости. Проверьте уровень анестезии при отсутствии педального рефлекса.
Как только стабильная хирургическая плоскость достигается, медленно и осторожно вводите иглу в ретро-орбитальное пространство под углом около 30 градусов. Медленно и плавно вводить CD11c положительной подвески DC. Как только инъекция завершена, осторожно удалите иглу для ретро-орбитального пространства, убедившись, что не повредить глаз.
Затем удалите мышей из конуса носа и контролировать их в течение примерно 30 минут во время восстановления от анестезии. Типичный анализ артериального давления показан здесь после принятия передачи DCs и осмотических мини-насосов, которые были имплантированы для низкой дозы ангиотензина II вливания. Следует отметить, что эта низкая доза ангиотензина II является доза супрессора, который не увеличивает кровяное давление в нормальной мыши.
Мыши, которые получают нормальную соль обработанных CD11c положительные DCs поддерживать нормальное кровяное давление во время инфузии, в то время как мыши, которые получают высокосоленые лечение CD11c положительные DCs демонстрируют увеличение систолического кровяного давления. Затем проводится анализ цитометрии потока с использованием показанной здесь стратегии гэтинга для определения чистоты изолированных положительных клеток CD11c. Увеличенное обогащение положительных клеток CD11c увидено сравнено к полным splenocytes.
Различные концентрации CD11c Microbead используются для устранения неполадок протокола производителя. Магнитное делее спленосов с использованием 100 микролитров microbeads дает около 65% положительных клеток CD11c, при использовании 200 микролитров дает 55%и с помощью 300 микролитров дает 50%Блокатор FcR включен вместе с 100 микролитров microbeads. После магнитного разделения, блокада FcR дает приблизительно 65%CD11c положительных клеток.
Некоторые спеноциты затем инкубируется 100 микролитров microbeads и магнитно разделены через колонку LS. Разделенные ячейки инкубированы дополнительными 100 микролитров CD11c и снова разделены через колонку LS. Этот процесс двойной изоляции дал 92%CD11c положительных клеток.
При попытке этой процедуры, важно, чтобы подтвердить чистоту изолированных клеток поток цитометрии. После магнитной изоляции дендритных клеток они могут быть культурны, чтобы определить их статус активации молекулярными методами, включая протеомику и одноклеточное секвенирование. С момента своего развития, в настоящее время можно изучить функцию и конкретную роль дендритных клеток в гипертонии.
Исследователи в настоящее время изучают конкретные антигены при гипертонии.
