Этот протокол позволяет проводить конкретную маркировку и последующее обогащение и идентификацию эндогенных субстратов CK2 из сложного биологического образца, такого как лизат клеток или тканей. Этот метод может быть применен к любому типу клеток или тканей. Таким образом, содействие, изучение CK2 в различных биологических контекстах.
Демонстрацией процедуры будет Джон Чойновски, аспирант моей лаборатории. Для начала механически высасыте образец ткани или культурные клетки, как указано в текстовом протоколе, чтобы собрать в общей сложности 900 микролитров образца. Центрифуга при 17 500 раз больше гравитации и при четырех градусах по Цельсию в течение трех минут.
Затем перенесите 270 микролитров супернатанта на каждую из трех новых микроцентрифугных трубок диаметром 1,7 миллилитра. Удалите 40 микролитров оставшегося супернатанта, которые будут использоваться в качестве входного управления, и перенесите его в новую трубку. Поместите все образцы на лед.
Во-первых, этикетка каждого из трех проб труб, как показано здесь. К трубке Реакции Kinase добавьте 2,7 микролитров CK2 и 2,7 микролитров 2,5 миллимолярной GTPgammaS. Флик трубки для смешивания, и сразу же поместить его на лед.
К только трубке GTPgammaS добавьте 2,7 микролитров 2,5 миллимолярной GTPgammaS и 2,7 микролитров Lysis Buffer. Флик эту трубку, чтобы смешать, и сразу же поместить его на лед. К PNBM только трубки добавляют 5,4 микролитров Lysis Buffer.
Флик трубки для смешивания, и сразу же поместить его на лед. Инкубировать все три трубки в водяной бане при 30 градусах по Цельсию в течение одной минуты. После этого добавьте 13,5 микролитров PNBM по 12 миллиграммов на миллилитр к каждой трубке.
Переверните трубки, чтобы смешать образцы, и инкубировать образцы при комнатной температуре в течение одного часа. В то время как образцы инкубируются, отметь каждый из столбцов для загрузки образца, как показано здесь. Подготовь столбцы, несколько раз инвертивировать каждую колонку, чтобы повторно использовать смолу Sephadex G-25 в буфере хранения.
Прикрепите каждую колонку к стенду зажима, и пусть он сидит спокойно в течение примерно пяти минут, чтобы смола оседает. Затем поместите трубку под нижнее отверстие каждой колонны. Удалите колпачки как сверху, так и снизу каждого столбца, чтобы буфер хранения стека в трубы под действием силы тяжести.
После того, как буфер хранилища истощается, добавьте приблизительно 2,7 миллилитров Lysis Buffer к каждому столбецу, чтобы уравночные их, убедившись, что собирать и отбрасывать поток через. Повторите этот процесс добавления Lysis Buffer и отбрасывания потока через, три раза. Для начала загрузите каждый образец в соответствующий столбец.
Соберите и отбросьте поток до конца. Добавьте 420 микролитров Lysis Buffer к каждому столбецу для мытья образцов. Пусть Lysis Buffer фильтрует через столбец, и собирать и отбрасывать поток через.
Затем поместите трубки в положение под каждой колонкой для сбора образцов. Добавьте 500 микролитров Lysis Buffer в каждую колонку, чтобы утоить образцы. Соберите поток через, который в настоящее время содержит обогащенную популяцию тиофосфорилированных и алкилатированных субстратов CK2 в реакции киназы.
Только реакция GTPgammaS будет содержать субстраты тиофосфорилированные и алкилированные любым эндогенным CK2 настоящее время. Только реакция PNMB будет содержать фоновые алкилатные белки. Удалите 80 микролитров из каждого Elution в качестве образца elution Input Control.
Затем разделите каждый образец на две трубки, каждая из которых содержит 200 микролитров. Этикетка каждой из трубок будет либо антитиофосфатного эстера или иммуноглобулина G, как показано здесь. Добавьте 2,8 микрограмма антитиофосфатного эстерного антитела к каждой из антитиофосфатных эстерных трубок.
Добавьте 2,8 микрограмма антитела Isotype Control к каждой из трубок IGG. Затем поместите трубки на ротатор при четырех градусах по Цельсию в течение двух часов. В течение последних 15 минут инкубации образца используйте чистое лезвие бритвы, чтобы отрезать конец наконечника пипетки P200, чтобы увеличить размер датчика.
Непосредственно перед использованием, кратко вихрь трубки хранения, содержащей агарозы бусы. Используя наконечник вырезать пипетку, перенесите 100 микролитров бусинки суспензии на иммунопреципитацию в новую микроцентрифугную трубку на 1,7 миллилитра. Важно, чтобы вихрь бусы перед каждой передачей, чтобы предотвратить бисер от урегулирования.
Центрифуга труб при 17 500 раз больше тяжести и при четырех градусах по Цельсию в течение одной минуты. Удалите и отбросьте супернатант. Resuspend шарики путем добавлять 200 микролитров буфера Lysis и кратко vortexing для того чтобы смешать.
Повторите этот процесс центрифугирования и мытья бисера три раза. После окончательной стирки, поместите бисер на лед, пока не будет готов к работе. Когда образцы закончили инкубацию, центрифуга их в 17500 раз тяжести и при четырех градусах по Цельсию в течение трех минут.
Затем перенесите 200 микролитров каждого образца в трубки, содержащие вымытые бусины. Поместите трубки на ротатор при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа. Далее центрифуга труб при 17 500 раз больше гравитации и при четырех градусах По Цельсию в течение одной минуты.
Удалите 40 микролитров из каждого супернатанта, чтобы сохранить в качестве контроля истощения. Удалите и отбросьте остаток супернатанта, будьте осторожны, чтобы не беспокоить бисер. Вымойте образцы, добавив 200 микролитров Lysis Buffer к каждому и вихревые кратко.
Центрифуга при 17 500 раз больше гравитации и при четырех градусах Цельсия в течение одной минуты, отбрасывая супернатант. Повторите этот процесс мытья и центрифугации три раза заботясь, чтобы не беспокоить бисер. После этого добавьте 50 микролитров буфера образца 2X к каждому образцу, содержащем бисер.
Для всех других образцов, которые включают в себя контроль ввода, elution Input Controls и элементы управления истощением, добавьте 8 микролитров буфера образца 6X. Pipette каждую трубку вверх и вниз, чтобы смешать с исключением труб, содержащих бисер, и тепла все образцы при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут, прежде чем приступить к SDS-PAGE. Чтобы оценить, была ли иммунопреципиентация успешной, запустите от 25 до 30 микролитров каждого образца, который ускользал от бисера на отдельном 12,5%полиакриламинидного геля.
Пятно каждого геля с Coomassie Blue для визуализации обогащенных белков из различных стадий экспериментального протокола. Используя новые, чистые лезвия бритвы, тщательно акцизных любых уникальных полос, присутствующих в киназы реакции антитиофосфат эстер IP Lane, делая к сведению их приблизительные молекулярные веса. Для каждой уникальной группы следует использовать новое лезвие бритвы.
Основой этого метода является необычная способность CK2 использовать GTP для передачи фосфориловой группы. Добавление экзогенного холоэнзима CK2 вместе с аналогом GTP, GTPgammaS, к лизате клетки, приводит к тиофосфорилированию эндогенных субстратов CK2. Последующее лечение лизата с алкилацией реагента p-Nitrobenzyl мезилат генерирует тиофосфат эстер moiety на этих конкретных белков субстрата, которые затем могут быть immunoprecipitated с помощью анти-тиофосфат эстер антитела и в конечном итоге определены масс-спектрометрии.
В репрезентативных положительных результатах, показанных здесь, зависимый CK2, тиофосфорилирование и последующая алкиляция были успешными. Как и ожидалось, усиленный антитиофосфатный эстерный сигнал от западного blotting наблюдается только в полосе, содержащей полную реакцию киназы, а не только в GTPgammaS и PNMB только обработанные образцы. Кумасси Синий окрашенный гель иммунопрофилированных и ссылаясь белков, также демонстрируют положительный результат.
Как несколько уникальных полос проявляются только в антитиофосфатном эстер IP Lane, в котором лизат был инкубирован с экзогенными CK2 и GTPgammaS. Отмеченная полоса затем выбана из геля и представлена для идентификации белка с помощью масс-спектрометрии. После этой процедуры, предположительно CK2 субстраты, выявленные масс-спектрометрии должны быть проверены с помощью дополнительного подхода, например, CK2 зависимых фосфорилирования в стандартной пробирке киназы анализа.
