Этот протокол позволяет исследователям контролировать выживаемость на основе одноклеточных и определять переменные, которые значительно предсказывают гибель клеток или выживание. Обычные анализы цитотоксичности оценивают популяции клеток и не имеют возможности различать отдельные клетки. Продольная микроскопия позволяет назначение времени смерти для каждой клетки в популяции.
Этот метод хорошо подходит для оценки новых методов лечения нейродегенеративных заболеваний и других заболеваний. Этот метод оказался бесценным для изучения механизмов заболевания в нейродегенеративных условиях, и может быть применен с одинаковой эффективностью по отношению к другим расстройствам, в которых гибель клеток представляет интерес. Исследователи могут бороться с достижением адекватной эффективности трансинфекции без чрезмерной токсичности.
Практика с многоканальной трубой и знакомство с протоколом должны уменьшить эти трудности с течением времени. Микроскопия по своей сути является визуальной методологией. Таким образом, метод может быть более легко понять, наблюдая в дополнение к чтению.
Для начала смешайте соответствующее количество пониженных средств сыворотки и реагента трансфекции в одной трубке, а также уменьшенные средства и ДНК сыворотки в отдельной трубке. Инкубировать их при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем смешайте содержимое обеих трубок и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут.
Используйте многоканальные пипетки и стерильные пластиковые желоба для мытья корковых нейронов два раза с 100 микролитров нейронных базальных средств массовой информации на колодец. И хранить кондиционированные средства массовой информации и другие оставшиеся средства массовой информации на 37 градусов по Цельсию. Замените НБМ на 100 микролитров ранее подготовленного решения NBKY на одну колодец.
Через 20 минут, трубы 50 микролитров трансфекции реагента и смеси ДНК dropwise в каждой хорошо. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Промыть клетки два раза с помощью решения NBKY.
Затем добавьте 100 микролитров кондиционированных средств массовой информации и 100 микролитров раствора NBC к скважинам. Чтобы начать визуализацию клеток, поместите пластину 96 хорошо на флуоресцентный микроскоп. Используйте фидуциарный знак, уникальный для каждой пластины, в качестве эталона для будущего выравнивания и сохраните изображение для будущей ссылки.
Затем перейдите в области, представляющие интерес, и заместить их координаты x и y относительно отметки. Используйте фидуциарный знак, уникальный для каждой пластины, в качестве эталона для будущего выравнивания и сохраните изображение для будущей ссылки. Наконец, сосредоточьтесь на трансфицированных клетках, выражаюх флуоресцентную этикетку.
Сделай несколько изображений через регулярные промежутки времени в соответствующих флуоресцентных каналах. Для начала обработайте изображение, дважды нажмите на значок Фиджи. Затем щелкните и перетащите изображение, подчеркивая обработку макроса на бар Фиджи, чтобы открыть макрос в Фиджи.
Отрегулируйте строки от двух до семи изображений, подчеркивая обработку макроса в соответствии с текстовым протоколом. Затем нажмите на шитье, а затем сетки / сбор стежка. Отрегулируйте настройки в меню высадки, ввех и порядок до тех пор, пока не будет получено точно сшитое изображение.
Отрегулируйте тип сетки и переменные порядка стежка в строках восемь и девять в соответствии с этими выделениями. Затем отрегулируйте строку 10, чтобы указать количество изображений на колодец и при необходимости установите параметр вычитания фона в строке 14, чтобы это было правдой. Отрегулируйте строку 15, чтобы установить радиус подвижного шара в соответствии с текстовым протоколом, и нажмите Run.
Наконец, откройте стеки выходных изображений и вручную определите мертвые нейроны в соответствии с текстовым протоколом. Запись данных в файле электронной таблицы. Для выполнения статистического анализа дважды нажмите на значок для выживания.
R скрипт. Выделите строку 2 и нажмите кнопку запуска, чтобы загрузить библиотеку выживания. Затем измените путь в строке 5, чтобы вызвать таблицу ввода, и нажмите кнопку запуска.
Выделите линии восемь и девять, и нажмите кнопку запуска для выполнения анализа пропорциональных опасностей Кокса. Выделите линии от 12 до 16 и от 19 до 24. Нажмите кнопку запуска, чтобы построить кумулятивный риск смерти и данные о выживании в качестве кривой Каплан-Мейер.
В этом исследовании, крысы корковых нейронов были трансфицированы в течение четырех дней после покрытия с плазмидной кодирования флуоресцентного белка M яблоко. 24 часа после трансфекции, нейроны были изображены с помощью микроскопии флуоресценции каждые 24 часа в течение 10 дней подряд. После получения изображения изображения были обработаны и тщательно изучены в ознаменование смерти клетки.
Время смерти каждой клетки определялось изменениями в флуоресценции, морфологии и фрагментации клеточного тела. Анализ пропорциональных опасностей Кокса, проведенный на данных о выживаемости мутантных нейронов, привел к соотношению опасности 2,2. Этот результат показал более быстрый уровень смертности в мутантных нейронах по сравнению с популяцией дикого типа.
Самое главное помнить при попытке этой процедуры является трубопровод тщательно. Минимизация воздействия воздуха и предотвращение пузырьков имеет решающее значение для успешной трансфекции. После трансфекции, продольная микроскопия флуоресценции может быть использована для отслеживания различных факторов, которые могут способствовать гибели клеток, включая локализацию белка, оборот и уровень экспрессии, в дополнение к выживанию клеток.
В области нейродегенерации динамический характер продольной микроскопии пролил свет на то, является ли агрегация связанных с болезнями белков токсичным или защитным событием. Ни один из этих реагентов или инструментов не является опасным.
