Ценность этого протокола заключается в том, что он позволяет практически любому штамму дискоида диктиостелия манипулировать молекулярной генетикой, независимо от того, будет ли этот штамм расти осечно в жидкой среде или нет. Другим преимуществом этой техники является то, что она быстрая и простая. Транспонировать к transfect клеткам с exochromosomal плазмидом перед начинать смешать dictyosteliums.
Результаты уже могут быть проверены через два дня после трансфекции с помощью микроскопии. Необычно работать с клетками диктиостелия и подвеской бактерий. Визуализация поможет дать экспериментаторам представление о том, как выполняются различные этапы протоколов.
Демонстрация процедуры со мной будет Soudabeh Imanikia, postdoc из моей лаборатории. Для начала приготовьте 1000 миллилитров буферного рабочего раствора соренсена с хлоридом магния и хлоридом кальция в соответствии с текстовым протоколом. После этого используйте одну колонию K аэрогенов для прививки одного литра ЛБ среды.
Позвольте бактериям расти в одночасье при 37 градусах по Цельсию при тряске. Спин клетки вниз в двух 500 миллилитров центрифуг трубки для сбора клеток. Затем, мыть бактерии один раз с 500 миллилитров буфера.
Переусердуйте гранулы в 20 миллилитров буфера. Используйте фотометр, чтобы проверить оптическую плотность образца и разбавить образец буфером до тех пор, пока оптическая плотность не будет около 100. После этого подготовьтесь к буферу электропорации H40 в соответствии с текстовым протоколом.
Расти K аэрогенов для слияния SM среды ночь при комнатной температуре. Добавьте 400 микролитров бактериальной суспензии в агарную пластину SM и равномерно распределив их. Затем возьмите стерильную петлю и привить ее клетками диктиостелия и распределить клетки на одном краю пластины.
Инкубировать пластину при 22 градусах по Цельсию в течение двух дней, чтобы зоны роста были достаточно большими для трансфекции. Добавьте 10 миллилитров подвески K aerogene в 10-сантиметровую ткань, обработанную культурой Петри. Затем используйте 10 микролитровую одноразовую петлю прививки, чтобы выскоблить клетки из зон роста культурной пластины.
Перенесите клетки в 1,5 миллилитровую трубку, содержащую ледяной буфер H40. Спин клетки в течение двух секунд при 10000 раз тяжести. Затем отбросьте супернатант и повторно посовекуйте клетки в буфере H40.
Затем добавьте 100 микролитров клеток в трубку, содержащую от одного до двух микрограммов ДНК. Pipette вверх и вниз, чтобы смешать и передать смесь ДНК клеток в предварительно охлажденной электропорации cuvette. Не добавляйте более двух микрограммов ДНК.
Более высокая концентрация ДНК токсична для клеток и снижает эффективность. После электропорации немедленно перенесите клетки в подготовленную 10-сантиметровую чашку Петри и дайте клеткам восстановиться в течение пяти часов. Чтобы выбрать трансфектант для нокаута, стук-в, или акт пять стук-в, отделить клетки от чашки Петри путем трубопроводов жидкости по поверхности.
Затем наймите три разбавления селективного агента в соответствии с текстовым протоколом. Наконец, распределить 150 микролитров подготовленных разбавлений в каждой колодец из 96-ну плоский дно ткани культуры пластин. В этом протоколе была продемонстрирована двухрепортовая экстрахромосомная плазмидная система.
Через 32 часа после трансфекции большинство клеток выразили оба флуоресцентных помеченных белками синтеза. Акт пять M вишни стук в и NC4 также была предпринята попытка. Две полосы были получены после запуска дайджеста на агарозный гель.
Базовая пара 4127 содержит нужную конструкцию. Очищенная ДНК использовалась для трансфекции клеток NC4. Два клона NC4 transfection были проанализированы с помощью ПЦР, и оба показали прогнозируемые модели полосы.
Затем для проверки результатов ПЦР использовалась южная помарка. NC4 рос быстрее на бактериальных газонах, чем клетки Ax2. Через четыре часа, больше клеток NC4 смогли ползти под агарозой, чем клетки Ax2.
Клетки NC4 были быстрее и показали более сильную химиотаксическую реакцию на фолат, чем клетки Ax2. Всегда используйте ячейки из свеженастроенных пластин SM. Никогда не используйте клетки старше четырех дней, в противном случае эффективность упадет.
Недавно изолированные, нексенические, белые штаммы HAP обычно используются для решения вопросов, касающихся ruching или социального поведения диктиостелия. Наша позволяет применять молекулярную генетику через эти изоляты.
