Нейронные стволовые клетки и клетки-предшественники могут самообновляться и дифференцироваться в различные типы нервных клеток, поддерживая развитие нервной системы и предлагая ресурс для регенеративной медицины. Эти клетки неоднородны, и мы должны знать их конкретные маркеры поверхности клеток, чтобы получить очищенные популяции клеток и понять их функции. Наш протокол обеспечивает простой, чувствительный и эффективный метод анализа мембранных белков первичных нервных стволовых клеток и клеток-предшественников, помогая определить новые маркеры поверхности для этих клеток.
Основным преимуществом нашего протокола является его способность непосредственно анализировать поверхностный протеом первичных нервных стволовых клеток и клеток-предшественников с улучшенной чувствительностью и специфичностью. Это достигается за счет расширения их за счет совместной культуры в эндотелиальных клетках in vitro и высокой трактин внутренней клеточной MAPK-ERK путь для обозначения поверхностных пор. С пор про-модификации по расширению стволовых клеток в пробирке, наш протокол может быть легко применен для выявления поверхностных маркеров других типов стволовых клеток.
Чтобы подготовить эндотелиальные клетки, повторно приостанавливайте гранулы клетки BEN3 из 10-сантиметровой чашки Петри при 90%-м слиянии с девятью миллилитров клеточной среды BEN3. Добавьте один миллилитр клеточной подвески в одну проницаемую опорную вставку. Добавьте еще два миллилитров среды BEN3 на колодец в нижней камере матрицы.
Продолжайте культуру клеток в течение одного дня при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. На следующий день после покрытия клеток в вставки, осторожно аспирировать среды, сначала из нижней камеры, а затем из вставок. Вымойте лицо вставки три раза с предварительно разогретой DMEM.
Вымойте внешнюю поверхность вставок путем полоскания предварительно разогретой DMEM. Затем добавьте один миллилитр предварительно разогретого AM в одну вставку. Перенесите вставки в скважины с первичными корковыми клетками.
Инкубировать совместно культуры при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение 12 часов. Растворите Ac4ManAz в DMSO для достижения концентрации запасов 200 миллимоляра. Извлеки нейро-эндотелианную ко-культурную пластину из инкубатора.
Добавьте один микролитер акций Ac4ManAz к каждой нижней камере и 0,5 микролитров на вставку в со-культуру. Культура клетки при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение пяти дней. В то время как клетки культивирования добавить 100 микролитров RM на вставку и 200 микролитров RM на нижнюю камеру, чтобы вновь кормить эндотелиальных и нервных клеток через день.
Сначала удалите вставки из со-культурных пластин и аспирировать культурную среду со дна колодцев. Затем мыть нервные клетки один раз с предварительно разогретой PBS. Аспирировать PBS из скважин и добавить один миллилитр предварительно охлажденных 4%paraformaldehyde в PBS к каждой скважине.
Исправьте клетки при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем мыть клетки три раза с предварительно охлажденной PBS. Аспирировать PBS и добавить один миллилитр свежеприготовленного биотина спряженного буфера 1 в каждую хорошо.
Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого, аспирировать буфер реакции из колодцев и мыть клетки три раза с PBS. Добавьте один миллилитр буфера окрашивания к каждому колодец клеток и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут.
Далее, аспирировать окрашивание буфера из колодцев и мыть клетки три раза с предварительно охлажденной PBS. Добавьте один миллилитр блокирующего буфера к каждой колодец клеток и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. Удалите блокирующий буфер из колодцев и добавьте по миллилитр первичного раствора антител к каждой скважине.
Инкубировать клетки на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующий день удалите первичный раствор антитела из колодцев. Вымойте клетки три раза с предварительно охлажденным PBS.
Аспирировать PBS из колодцев и добавить один миллилитр вторичных антител к каждому колодец. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение двух часов. После этого, аспирировать раствор из колодцев и мыть клетки три раза с предварительно охлажденной PBS.
Во-первых, подготовить BTTAA куприк сульфат комплекс 2, полный буфер повторной подвески белка, белка стиральный буфер 1, белка стиральный буфер 2 и белка стиральный буфер 3, как указано в текстовом протоколе. Затем удалите вставки из со-культурных пластин. Аспирировать культурную среду из нижних колодцев и мыть нервные клетки один раз с предварительно охлажденным PBS.
Аспирировать PBS и добавить 200 микролитров предварительно охлажденных буфера RIPA к каждой хорошо. Инкубировать пластины на льду в течение пяти минут, а затем собирать лиз белка в 1,5 миллилитров труб. Центрифуга в 12000 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гранулировать клеточный мусор.
Перенесите супернатант в новые 1,5 миллилитровые трубки и определите концентрацию белка с помощью комплекта BCA в соответствии с инструкциями производителей. Затем отрегулируйте концентрацию белка до одного миллиграмма на миллилитр. Добавьте 100 микромоляных алкид биотинов, 2,5 миллимолярный аскорбат натрия и 1XBTTAA купричный сульфатный комплекс 2 к одному миллилитру белкового лиза.
Хорошо смешайте раствор и инкубировать его при комнатной температуре в течение одного часа. После этого перенесите раствор реакции в 20 миллилитров предварительно охлажденного метанола в 50 миллилитров конической трубки. Хорошо перемешать и инкубировать на ночь при температуре минус 30 градусов по Цельсию, чтобы вызвать белки.
Центрифуга при 4500 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут, чтобы гранулировать белковые осадки. Вымойте гранулы дважды, используя 20 миллилитров предварительно охлажденного метанола на стирку. Далее, аспирировать супернатант и вновь приостановить белковые гранулы в четырех миллилитров буфера повторной подвески.
Перенесите белку повторной суспензии в новую 15 миллилитров конической трубки. Вымойте 50 микролитров стрептавидина бисером три раза с PBS. Добавьте промытые бусы к повторной суспензии белка и инкубировать раствор при четырех градусах Цельсия в течение трех часов на вертикальном ротаторе со скоростью вращения 20 об/мин.
После этого, мыть бисер последовательно с каждым стиральный буфер показано здесь. Повторно приостанавливайте промытые бусины с помощью 20 микролитров PBS и перенесите их в новую 1,5 миллилитровую трубку. Добавьте 20 микролитров буфера загрузки белка 2X и обработать при 95 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Затем обработать образцы белка с SDS-PAGE и пятно их с Кумасси Блестящий синий, как указано в текстовом протоколе. В этом исследовании первичные эмбриональные NSPCs расширены и метаболически помечены in vitro. Успешная эндотелиальная ко-культура приводит NSPCs к формированию больших листовых клонов.
Иммуностай с антителами показывает, что в клоне, большинство клеток Nestin положительные NSPCs, в то время как очень немногие из них бета тубулин 3 положительных нейронных клеток. В отличие от этого, процент положительных клеток Nestin и бета-тубулина 3 положительных нейронных клеток в клонах, образованных в не-культурной системе, почти одинаковы. Химический репортер Ac4ManAz является метаболическим аналогом и может быть включен в внутренний путь сиалиляции белка.
Используется оптимизированная концентрация маркировки 100 микромолей для первичных NSPCs и комбинированная оценка клеточной смерти, указанной клеточной и нуклеинной морфологией, позволяет предположить, что эта концентрация маркировки не вызывает очевидных цитотоксических эффектов и способна эффективно маркировать NSPCs. Потенциал клональной морфологии, самообувечения и дифференциации НСПК как в эндотелиальной совместной культуре, так и в системе несоциальной культуры не затрагивается. Образцы белка, подготовленные из Ac4ManAz помечены культуры биотин спряжения и стрептавидина бусы очистки показывают сильный Coomassie Блестящий синий сигнал окрашивания в SDS-PAGE гелей.
Между тем в полосах, загруженных образцами белка из контрольной группы ДМСО, были только окрашивание фона и неспецифические связывающие сигналы. Это также указывает на эффективную маркировку НСПК ac4ManAz. При попытке этого протокола, все решения, необходимые для биоклеточной реакции должны быть подготовлены свежей и время реакции должны контролироваться жестко, чтобы предотвратить более недостаточной реакции.
В соответствии с нашим протоколом может быть проанализирована структура обогащенного нервно-стволовыми клетками поверхностного гликан. Наш протокол нервных стволовых и прародителя клеток обогащенных поверхностных белков не только рост маркеров, но и играть важные функции на поднятой стратегии очистки шаблона и иллюстрация rigiditory схемы сигнала для этой популяции клеток.
