Этот протокол может быть успешно применен как для индуцирования важных воспалительных и фиброзных ответ в обоих легких эндотрахеальной инъекции блеомицина и для проверки новых противовоспалительных и противофиброзных системных методов лечения путем инфузии хвостовой вены. Основным преимуществом этой техники является то, что прямое впрыскивание блеомицина в мышеловую трахею обеспечивает быстрое нацеливание легких без каких-либо разливов в верхних дыхательных путей, что обеспечивает безопасную, надежную и воспроизводимую индукцию воспалительных и фиброз легких. Демонстрация процедуры будет Dr.Fiorenza Орландо, ветеринарный врач из нашей сотрудничающей лаборатории.
Для начала распоимите анестезируемую мышь, лежащую на спине, на хирургической платформе. Деликатно исправить его ноги с хирургической лентой полосы, чтобы держать его на месте. Чтобы гипер расширить шею мыши, поместите поддержку, такую как зубной хлопчатобумажный рулон под его шейной области.
Затем используйте лезвие бритвы, чтобы аккуратно побрить горло. Используйте пару анатомических щипец, чтобы ущипнуть кожу. Используйте пару кольцо обрабатываются изогнутые тупые ножницы, чтобы сделать короткий разрез около половины сантиметра в длину в соответствии с мышью sternohyoid мышцы.
Используйте ватные палочки, чтобы остановить кровотечение. Затем экстерьер трахеи тупым вскрытием и аккуратно очистить его от жира и других тканей. Поверните хирургическую платформу, чтобы сориентировать мышь головой к оператору, что позволяет оператору во время инъекции правильно заосшат шприц.
Чтобы визуализировать трахею, поместите мышь под операционный микроскоп. Отрегулируйте освещение и установите увеличение между 1 и 1.2 затем отрегулируйте фокус и резкость. Трахею легко отличить как белую полупрозрачную трубку с хорошо видимыми трахеей.
Аккуратно пипетку смешать раствор блеомицина и аспирировать 100 микролитров в шприц 0,5 миллилитра с 25 калибровочной иглой, избегая образования пузырьков. После того, как трахея четко визуализированы, тщательно проколоть его кончиком иглы под углом 30 градусов. Медленно впрыснуть 100 микролитров блеомицина непосредственно в люмен трахеи.
Прождя несколько секунд для всего объема, чтобы путешествовать вниз иглы, удалить его из трахеи. Наблюдайте несколько секунд апноэ происходит, когда игла правильно вставляется в трахею, указывая, что весь объем жидкости был вдыхается. Безопасно отбросьте шприц и иглу.
Закройте подкожной фасции и раны кожи с 5-0 абсорбируемых швов и дать животному восстановиться. После анестезии мыши снова и как только бессознательное было подтверждено, поместите мышь под стерильный капюшон. Используйте маску для лица с непрерывным потоком 1,5%isoflurane для поддержания мягкой анестезии на протяжении всего эксперимента.
Для содействия вазодилатации и обеспечить более легкую инъекцию, замочить хвост в теплой воде в течение двух минут. Смешайте суспензию пуповины человека мезенхимальных стромальных клеток, мягко трубы, чтобы избежать образования клеточного сгустка. Аспирировать 200 микролитров в один миллилитр шприц с 26 калибровочных игл избежать образования пузыря.
Держите хвост за кончик и аккуратно выпрямите его. Затем найдите боковой вены хвоста. Аккуратно соскребите хвост скальпелем и протрите его 70%этанолом.
Начиная с дистальной части хвоста, вставьте иглу в вену под углом 15 градусов. Медленно влить 200 микролитров пуповины человека мезенхимальных стромальных клеток. Для контроля успешного внутривенного вливания наблюдайте за жидкостью, поступающих в вену без сопротивления и отсутствия экстравасации.
После ожидания несколько секунд, пока весь объем путешествует вниз иглы, удалить его из вены. Затем кратко нанесите давление на входную рану стерильной марлей, чтобы предотвратить кровотечение и позволить животному восстановиться. Безопасно отбросьте шприц и иглу после инфузии.
После инъекции блеомицина, гистопатологические изменения легких были оценены гематоксилин и Эозин и Пикросириус Красное окрашивание подтверждающие обширные воспалительные инфильтрации и фиброз по сравнению с нормальной архитектурой легких после солевой инъекции. Воспаление легких и фиброз, вызванные блеомицином, были в значительной степени затуманены мезенхимальным инфузией стромальных клеток человека, но не солевым раствором. Осаждение коллагена измерялось с помощью гидроксипролина.
После инъекции блеомицина уровень гидроксипролина постепенно увеличивался с восьмого дня до 14 и 21 дня. В то время как добавление пуповины мезенхимальных стромальных клеток человека значительно уменьшило действие блеомицина. Уровни экспрессии Гена коллагена типа Col1A1 в целом мРНК легких также показали прогрессирующее увеличение в дни восемь, 14 и 21, который был частично сокращен путем лечения пуповины пуповины мезенхимальных стромальных клеток.
Иммуностимулятор с специфическими антителами показал, что перелив пуповины человека мезенхимальные стромальные клетки быстро и эффективно достигли легких мыши, хотя было обнаружено лишь несколько клеток. Эти данные свидетельствуют о быстром вывихе клеток из места травмы, несмотря на длительный защитный эффект. Использование операционного микроскопа обеспечивает высокую уверенность в успехе, позволяя оператору точно контролировать правильное размещение иглы в мышеловку перед установкой, тем самым минимизируя риск повреждения ее.
