Этот протокол описывает технику платформы для изоляции микрососудистых эндотелиальных клеток от скелетных мышц. Эти клетки могут быть использованы, например, для получения дополнительной информации о функциях геммокбарьера. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими методами является то, что можно изолировать первичные микрососудистые эндотелиальные клетки с высокой чистотой.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунной опосредованные заболевания мышц, такие как взаимодействие между мышцами и эндотелиальных клеток в области здравоохранения и болезней. Во-первых, подготовить все необходимые решения и шесть пластин, как описано в протоколе. Чтобы начать практическую процедуру, получить пару хирургических острых / тупые ножницы, пара хирургических острых / острых ножниц, и прямые и изогнутые типсы.
Дезинфицировать все хирургические инструменты 70%этанолом. Распоить усыпанную взрослую мышеловку на спине и смочить ноги 70%этанолом. Используя острые / тупые хирургические ножницы, разорвать каждую всю ногу, разрезая на тазобедренном суставе.
Поместите конечности в закрытом блюде клеточной культуры. Перенесите блюдо в стерильный ламинарный капюшон. Используйте острые ножницы и изогнутые типсы, чтобы разрезать кожу открытой от бедра до кончика носа.
Используйте прямые типсы, чтобы держать ногу или ногу площадку при использовании изогнутых типсов, чтобы очистить кожу от ног до бедра. Чтобы изолировать мускул четырехглавой бедренной кости, вырезать сухожилие от колена, и разорвать мышцы вдоль бедренной кости до бедра. Разорвать ахиллово сухожилие, чтобы изолировать musculus трицепс суры.
Далее, вырезать вдоль голени к popliteal fossa и удалить мышцы. Чтобы удалить сухожилия, которые не могут быть разобщены, удерживайте мышцы изогнутыми мипсами и отрежьте каждое соответствующее сухожилие. Добавьте 2, 445 микролитров подготовленного раствора пищеварения в свежее, помеченное блюдо клеточной культуры и определите вес.
Перенесите все кусочки мышц на это блюдо. Затем определите вес. Разница обоих измеренных значений обеспечивает сухой вес мышечной ткани, который не должен превышать одного грамма.
Используя хирургические острые ножницы, разрежьте всю мышечную ткань на мелкие кусочки. Инкубировать подвеску ткани при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение 1,5 часов, убедившись, что тщательно смешивать суспензию с одноми миллилитровым инсулиновым шприцем каждые 20 минут в течение примерно пяти минут. После инкубации перенесите подвеску на 70-микрометровый нейлоновый ситечко, помещенное на 50-миллилитровую помеченную трубку, и соберите поток.
Вымойте клеточный ситечко с восемью миллилитров DMEM и собирать поток до конца. Если части подключаются к ситечко, resuspend диссоциированный раствор. Отбросьте клеточный ситечко и центрифугу подвески при 300-м раз большей тяжести и при 20 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Аккуратно удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в один миллилитр хлористого хлорида аммония для лиза для лиза красных кровяных телец. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 секунд. Затем добавьте девять миллилитров DMEM, содержащих 10%FCS, чтобы остановить реакцию.
Перенесите подвеску клетки в 15-миллилитровую трубку. Затем используйте камеру подсчета клеток Нойбауэра для определения номеров клеток. Чтобы начать истощать CD45-положительные клетки, центрифуга подвески при 300-м раз гравитации и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
Удалите супернатант полностью и повторно основой клеточной гранулы в 90 микролитров буфера MCS. Добавьте 10 микролитров микробаз CD45 и смешайте подвеску. Инкубировать в холодильнике при 4-8 градусах по Цельсию в течение 15 минут.
После этого добавьте один миллилитр буфера MCS. Центрифуга при 300-времени гравитации и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Удалите супернатант полностью и повторно наполнить клетки в 500 микролитров буфера MCS.
Распоить большую магнитную колонку в магнитном поле сепаратора. Промыть резервуар колонны тремя миллилитров буфера MCS. Затем поместите 15-миллилитровую коническую трубку под столбец, чтобы собрать поток через.
Нанесите всю ячейку подвески на колонку и дайте ей пройти полностью. Вымойте столбец три раза, добавив три миллилитров буфера MCS в резервуар для каждого шага стирки и ожидая, пока резервуар колонны пуст перед началом следующего шага стирки. Соберите неоцеличные ячейки, проходящие через столбец для использования в дальнейших шагах разделения.
Чтобы начать накапливать CD31-положительные клетки, используйте камеру подсчета клеток Neubauer для определения числа клеток. После этого центрифугает неоцеличные клетки при 300-м раз большей гравитации и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Удалите супернатант полностью и повторно помесить гранулы в 90 микролитров буфера MCS.
Добавьте 10 микролитров микробаз CD31 и смешайте всю подвеску. Инкубировать в холодильнике при 4-8 градусах по Цельсию в течение 15 минут. После этого добавьте один миллилитр буфера MCS и центрифуги при 300-м раз большей гравитации и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
Удалите супернатант и повторно посовелите клетки в 500 микролитров буфера MCS. Распоить средний магнитный столб в магнитном поле сепаратора. Промыть столбец 500 микролитров буфера MCS.
Затем поместите 15-миллилитровую коническую трубку под столбец, чтобы собрать поток через. Нанесите всю подвеску ячейки на столбец и дайте ей полностью протекать. Вымойте столбец три раза, добавив 500 микролитров буфера MCS в резервуар для каждого шага стирки, и подождите, пока резервуар столба пуст перед началом следующего шага стирки.
Неоцеличные ячейки, проходящие мимо столбца, представляют собой CD45-отрицательную, CD31-отрицательную фракцию. Храните их для дальнейшего контроля качества. Затем снимите столбец с сепаратора и поместите его на подходящую трубку сбора.
Пипетт два миллилитров буфера MCS на колонну. Немедленно нажмите поршень в столбец, чтобы промыть магнитно помеченные клетки. Эта CD45-отрицательная, CD31-положительная фракция представляет собой обогащенный первичный murine ECs.
Центрифуга подвески клетки при 350-времени тяжести и при 20 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Удалить супернатант полностью и повторного перерасхода клеток в один миллилитр эндотелиальной клеточной среды. Перенесите клетки в один колодец покрытой пластиной культуры с шестью колодецами, содержащей один миллилитр эндотелиальной клеточной среды.
Для выращивания, инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в стерильном инкубаторе, убедившись, что обновить средний каждые два-три дня. Когда клетки находятся на 80 до 90% слияния, промыть каждый хорошо содержащие клетки в два раза с двумя миллилитров PBS в два последовательных шагов стирки. Затем добавьте 800 микролитров раствора трипсина EDTA в каждую колодец и инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%-ным углекислым газом в стерильном инкубаторе в течение трех-пяти минут.
После этого добавьте 1200 микролитров DMEM, содержащих не менее 10% FCS, чтобы остановить энзиматические действия. Центрифуга при 350-времени гравитации и при 20 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Затем аккумулировать клетки CD31, как описано ранее, чтобы увеличить чистоту.
Используйте яркое поле или стандартный фазовый контрактный микроскоп с 20%-ным увеличением и численной диафрагмой 0,35 объектива для наблюдения за слиянием клеток. В этом исследовании, первичные murine скелетных мышц микрососудистых эндотелиальных клеток изолированы. На следующий день после изоляции первичные мурин-ММЕКи и остаточные другие клетки образуют конгломераты и придерживаются дна культурных блюд.
С седьмого дня можно наблюдать плоские и удлиненные клетки, однако, загрязнение других, в основном сфероидных клеток все еще видно. Таким образом, требуется еще один цикл CD31-положительного отбора через MCS. В дальнейшем первичные murine MMECs размножаются до плотности от 80 до 90%После слияния они обычно образуют некрывающийся монослой продольно выровненных клеток.
Распространение прекращается при слиянии из-за ингибирования контакта. Контроль качества с помощью цитометрии потока показывает значения как жизнеспособности, так и чистоты в диапазоне около 70% для клеток сразу после изоляции. Клетки, культивируемые после другого CD31-положительного отбора через MCS, показывают удовлетворяющие значения для чистоты, а также для жизнеспособности, в диапазоне до 95%каждый.
Полученные клетки затем исследованы для экспрессии генов маркера клеток мышцы спутниковых клеток в паре белка коробки 7 и M-кадерин на уровне мРНК по количественным ПЦР. Как и ожидалось, только CD45-отрицательный, CD31-отрицательная фракция, а также дифференцированные первичные мышечные клетки мурина выразили коробку белка 7 и M-кадерин, в то время как CD45-отрицательный, CD31-положительный и первичный мурин MMECs являются отрицательными для этих маркеров. После второго шага CD31 MCS, qPCR используется для оценки экспрессии плотных белков соединения в стечении первичных ММЕЦ.
Первичные murine MMECs, как видно, выражают высокий уровень claudin-5, occludin, и zonula occludens-1, в то время как pmMC показывает только низкое выражение zonula occludens-1. Этот метод может быть выполнен в течение пяти-шести часов. Следуя этому протоколу, для ответа на дополнительные вопросы могут быть проведены другие методы, такие как анализ миграции или эксперименты с низким уровнем стресса.
После просмотра этого видео, вы должны быть в состоянии изолировать первичные микрососудистые эндотелиальные клетки от скелетных мышц механика и энзиматической диссоциации и магнитной сортировки клеток.
