Этот протокол помогает в расследовании роли иммунных клеток, в частности органов в здоровье и патологии. Основным преимуществом этого метода является то, что это экономически эффективный метод, так как это ручная техника. Демонстрация процедуры будет Чжэнкан Луо, аспирант из моей лаборатории.
Для начала поместите тимические железы и селезенки от ранее усыпленных мышей в 20 мл сцинтилляционных фиал, или 15 мл конических трубок, наполненных 5 мл сбалансированного соленого раствора Хэнка. Поместите дренажные лимфатические узлы поджелудочной железы в 1,5 мл микротрубок, наполненных 1 мл RPMI-1640. Убедитесь в том, чтобы использовать весь тимус и селезенки, и все PDLNs.
Держите органы на льду на протяжении всей процедуры. Используя ножницы, тщательно сжать тимуса и селезенки, чтобы освободить иммунные клетки. Откажитесь от оставшихся тимических и splenic капсул.
Перенесите подвеску клетки в коническую трубку 15 мл. Центрифуга в 433 раза г и при 4 градусах по Цельсию в течение пяти минут, и отбросить супернатант. Чтобы вынизыть эритроциты, повторно приостановить подвеску клетки в 5 мл хлорида аммония молара 0,2 моляра и инкубировать при комнатной температуре в течение десяти минут.
Переверните трубки осторожно каждые две минуты. В конце инкубации добавьте 5 мл HBSS, чтобы остановить лиз. Центрифуга труб в 433 раза г и при 4 градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клетки примерно в 5 мл HBSS. Затем заполните трубки HBSS. Повторите этот процесс, от центрифугирования образцов до заполнения трубки HBSS, один раз.
Центрифуга труб еще раз в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы в HBSS. Получить 5 мл круглых нижних трубок с крышками клеточного напряжения.
Перенесите 1 мл подвески тимических клеток и 500 микролитров подвески splenic cell в трубки, применив подвеску к крышкам клеточного напряжения. Во-первых, поместите 15 мл конической трубки в стойку. Поместите стерильную 250-метровую металлическую сетку над трубкой.
Промыть сетку 1 мл RPMI. Затем перенесите лимфатические узлы в металлическую сетку и используйте пару пинцетов, чтобы измельчить их через сетку. Нанесите 1 мл RPMI на сетку, чтобы промыть клетки в трубку.
Повторите этот процесс передачи и шлифования лимфатических узлов три раза для каждого образца, а затем удалите сетку. Центрифуга труб в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клетки примерно в 5 мл RPMI.
Затем заполните трубки RPMI. Повторите этот процесс, от центрифугирования образцов до заполнения трубки RPMI, один раз. Центрифуга труб снова в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клеточные гранулы в 2 мл RPMI. Перенесите 2 мл клеточной суспензии в 5 мл трубок с круглым дном с крышками клеточного напряжения. Во-первых, центрифуга клеточной суспензии из образцов тимуса, селезенки и PDLN в 433 раза g и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Откажитесь от супернатанта. Пятно клеток с поверхностными антителами, как указано в текстовом протоколе, и инкубировать трубки на льду в течение 40 минут. Затем добавьте 200 микролитров буфера FACS к каждой трубке.
Центрифуга в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, и отбросить супернатант. Повторите этот процесс, добавляя буфер, центрифугирование и отбрасывая супернатант, один раз. Повторно приостанавливайте ячейку гранул в 500 микролитров буфера фиксации пермяки для фиксации и проницаемой ячейки.
Перенесите трубки в холодильник при четырех градусах по Цельсию на ночь. На следующий день центрифуга труб в 433 раза g и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клеточные гранулы в 500 микролитров пермяки стирального буфера.
Центрифуга клетки снова в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут и отбросить супернатант. Пятно клеток с внутриклеточными антителами, как указано в текстовом протоколе. Инкубировать трубки на льду в течение 1 часа.
После этого добавьте в каждую трубку 500 микролитров пермяки стирального буфера. Центрифуга в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы в 500 микролитров пермяки стирального буфера.
Центрифуга еще раз в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы ячейки в 300 микролитров буфера FACS. Затем проанализируйте клетки на цитометре потока, как указано в текстовом протоколе.
В этом исследовании, одиночные клетки изолированы от тимических желез, PDLNs и селезенки нормальных гликемических мышей NOD, и окрашены маркерами клеток Treg, CD4, CD25, Foxp3, Helios, и нейропилин-1 для цитометрического анализа потока. Результаты анализируются и отображаются здесь в качестве репрезентативных стратегий закрытых. Доля Гелиос-положительных клеток среди CD4-положительных, CD8-отрицательных, CD25-положительных, Foxp3-положительных клеток Treg, как представляется, выше, чем у Nrp1-положительных клеток во всех трех органах.
Более 80% клеток Treg в тимусе, как видно, выражают Гелиос, который выше, чем в PDLN, и селезенки. Доля NrP1-положительных клеток среди Гелиос-положительных клеток Treg, как видно, выше в PDLN, чем в тимусе или селезенке. Большинство Nrp1-положительных клеток Treg также выражают Гелиос, и доля Гелиос-положительных клеток среди Nrp1 положительных клеток Treg, как видно, выше в тимусе и селезенке, чем в PDLN.
Вместе эти результаты показывают, что Гелиос является лучшим маркером для обнаружения Т Т трег клеток, чем Nrp1. Лимфатические узлы малы, но некоторые внутриклеточные маркеры требуют большого количества клеток, чтобы дать хороший сигнал в цитометрии потока. Другие методы не могут быть выполнены после этой процедуры, потому что клетки уже окрашены и мертвы.
Но четыре клеточных маркера животного могут быть заменены для изучения других типов иммунных клеток.
