Микробные патогены, которые размножаются внутриклеточно, должны в конечном итоге выйти из инфицированной клетки. Что, по сравнению с другими аспектами взаимодействия патогенов-хозяина, относительно недостаточно изучено. Здесь мы описываем методы анализа патогенного эффлюкса.
Мы показываем, как относительно просто анализы могут быть использованы либо для оценки эффективности эффлюкса или характеризуют пост-эффлюкс патогенов Общие методы, описанные здесь широко применимы, хотя конкретные модели клеток-хозяинов патогенов могут отличаться в кинетике, дозах и, возможно, считывателях. Как и при создании какой-либо экспериментальной системы, крайне важно установить четкий контроль, который обеспечит соблюдение подлинных биологических процессов в экспериментальных образцах или когортах. Демонстрацией процедуры будет Петория Гейл, аспирантка из моей лаборатории.
Для начала инфекционного эксперимента используйте пипетку, чтобы добавить в колодцы 20 микролитров свежеприготовленного Lm inoculum, при этом блюдо слегка наклонено, а кончик пипетки аккуратно помещается в чрезмерное ось. Избегайте прикосновения к стенам колодец с наконечником пипетки. Аккуратно пипетка содержимое каждого хорошо, чтобы обеспечить полное смешивание.
Не трясти или значительно наклонить пластину, чтобы избежать распространения LM над стенами хорошо. Верните блюдо клеточной культуры в 37 градусов по Цельсию, пять процентов инкубатора двуокиси углерода. Используйте условные средства массовой информации из неинфицированных клеток в качестве разбомбительного для подготовки 10 микрограмм на миллилитр раствора гентамицина.
На 30 минут после заражения, осторожно добавить 30 микролитров раствора гентамицина в блюдо, чтобы достичь конечной концентрации двухточечий пять микрограмм на миллилитр. Аккуратно пипетка содержимое хорошо смешать и вернуть блюдо клеточной культуры в инкубатор. Чтобы собрать урожай, слегка наклоните блюдо и осторожно используйте пипетки, чтобы удалить весь меас из колодец.
Добавьте в колодец пяти миллилитров дистиллированной стерильной воды. Через 30 секунд перенесите полученную воду лизат в микроцентрифугную трубку с одной точкой пять миллилитров и вихрь энергично в течение 10 секунд. Добавьте четырехтокаправленные пять микролитров и 50 микролитров воды к 450 микролитров дистиллированной стерильной воды для подготовки десятикратного и стократного разбавления.
Кратко вихрь для обеспечения тщательного смешивания. Добавьте 50 микролитров оригинальных десятикратных разбавленных и стократных разбавленных образцов на лизогенный бульон агар пластины, и распределить с помощью пластины распределитель. Для анализа новых LM, извлечь 10 микролитров наложения средств массовой информации из блюда и разделить его на два пятиминерных aliquots и микро центрифуг трубки.
Добавьте пять микролитров DMEM/FCS в одну алициту и добавьте пять микролитров DMEM/FCS, содержащих пять микролитров на миллилитр гентамицин, во вторую алициту в качестве контроля. Подождите пять минут при комнатной температуре. Добавьте 90 микролитров дистиллированной стерильной воды в каждую алициту и вихрь два энергично в течение 10 секунд.
Затем добавьте 50 микролитров образца на пластины LB agar и распределите с помощью распределители пластин. Храните пластины в 37 градусов по Цельсию инкубатор в течение двух дней, прежде чем перечислять Lm колоний. Используя автоматизированный счетчик ячеек, отрегулируйте подготовленные, сырые две-шесть-четыре точки семь клеток к концентрации один раз от 10 до шестой клетки на миллилитр.
Добавьте один миллилитр образца в скважины из шести скважин ткани культуры пластины. Заразить клетки с подготовленным Lm inoculum, что соответствует множественности инфекции 50. В одной точке пять часов после заражения, в одной точке пять миллилитров микроцентрифуг трубки заполнены 500 микролитров четыре процента PFA, собирать средства массовой информации из первого набора скважин и место трубки на льду.
Для сбора внутриклеточной Lm, добавить один миллилитр дистиллированной, стерильной воды в каждой хорошо. Через 60 секунд перенесите полученный лизат воды в одноточек пять миллилитров микроцентрифуг трубки с 500 микролитров четырехпроцентной ПФА. Вихрь трубки энергично в течение 10 секунд и поместить его на лед.
Для остальных скважин удалите мультимедиа и замените на один миллилитр DMEM/FCS пятими микрограммами на миллилитр гентамицин, чтобы убить внеклеточный Lm.Promptly вернуть блюдо в инкубатор. Через 30 минут удалите мультимедиа и замените DMEM/FCS без гентамицина. Еще через два-четыре часа собирайте средства массовой информации в лисаты во второй и третий раз поставить точку в трубках и поместить их на лед, чтобы охладить.
Центрифуговые трубки по 10 000 раз G в течение семи минут. Используя пипетку, удалите супернатант, не нарушая гранулы. Добавьте окрашивающий коктейль, содержащий 50 микролитров четырехпроцентного ПФА и 15 микролитров фаллоидин в трубку и смешайте, чтобы приостановить каждую гранулу.
Инкубировать трубки в темноте при четырех градусах по Цельсию в течение 20 минут. После инкубации добавьте один миллилитр буфера FACS к каждой трубке и пипетке вверх и вниз, чтобы перемешать. Спиновые трубки в центрифуге по 10 000 раз G в течение семи минут.
Удалите супернатант, не нарушая гранулы. Для немедленного использования приостанавливайте каждую гранулу в 400 микролитров буфера FAX. При хранении для более тщательного анализа добавьте 200 микролитров буфера FAX и 200 микролитров по четыре процента PFA в трубку и смешайте, чтобы приостановить.
Использование инфекционных условий в кратком лечении антибиотиком гентамицина для устранения невоинализированных Lm, нулевой точки один-пять процентов дикого типа Lm восстанавливается после одной точки пять часов совместного инкубации с культурными макрофагами. В ходе последующей совместной инкубации произошло четырехкратное и пятиохократное увеличение восстановления жизнеспособного ЛМ, которые представляют собой исключительно внутриклеточное распространение. Сопоставимый профиль наблюдался для штамма Lm, обладая гипервирулянтной prfA во время первоначальной инфекции, но не между тремя и шестью HPI.
Когда prfA был удален из штамма Lm, есть последующее снижение восстановления штамма после длительного совместного инкубации. Когда гентамицин удаляется из скважин в шесть HPI, внеклеточный Lm может быть обнаружен через час для диких типа и гипервирулянтных штаммов prfA, но не для штамма с prfA удалены. Средства массовой информации, накладыв как неинфицированные, так и инфицированные макрофаги, содержали светоразбрасывные твердые частицы размером с бактерию.
Однако только средства массовой информации из зараженных макрофагов обладали положительными сигналами GFP в пределах размера gating. С инфицированными макрофагами наблюдалось во времени увеличение появления фаллоиден-положительного Lm. При обливки макрофагов в 48-хорошо ткани культуры блюдо, оставить некоторые скважины без клеток.
Эти неклеточные контрольные скважины затем обрабатываются точно так же, как клеточные скважины, с точки зрения добавления патогена, антибиотиков и т.д., чтобы гарантировать, что экспериментальные сигналы зависят от присутствия клеток-хозяй. Подобно экспериментам, показанным на цифрах один и три, патогенные или принимающие факторы и или небольшие молекулы могут быть проверены на их влияние на патогенный клеточный эффлюкс.
