hiv 转录和拼接中延迟逆转剂的高通量体外评价

这一程序的总体目标是评估体外，延迟逆转剂对HIV mRNA处理的影响。该协议提供了一种简单、高效和可靠的方法，用于同时评估上帝抵抗军对艾滋病毒转录和拼接的影响。该技术提供了对LRA诱导病毒重新激活和清除潜伏储层的能力的见解。

培养细胞后，将2万个细胞放在100微升DMEM培养基中，辅以10%FBS，在96孔平底板的井中放置2万个24小时无抗生素。第二天稀释了双色记者构造。Tat 和 Rev DNA 在 50 微升的血清自由介质中，轻轻混合。

轻轻混合脂质试剂，然后在50微升的血清自由介质中每反应稀释0.65微升。轻轻混合，在室温下孵育五分钟。将稀释的脂质试剂与稀释的DNA混合，轻轻混合。

在室温下孵育20分钟。然后，在每种井的细胞顶部，将100微升这种脂质试剂DNA复合物滴下。轻轻来回摇动盘子以混合。

在加湿的培养箱中孵育板，温度为37摄氏度，二氧化碳含量为5%，为期5小时。在此之后，转染额外的井与100纳米的CMV驱动EGFP和DsRed快速DNA质粒补偿目的。首先，使用生长介质将每个延迟倒转剂稀释到适当的工作状态。

使用多通道管头，小心吸气转染介质，代之以含有适当延迟倒转剂的100微升介质。在37%摄氏度的加湿孵化器中孵育，用5%的二氧化碳孵育48小时。要开始染色细胞，请使用多通道管头向每井添加 100 微升 PBS。

轻轻管头向上和向下约五次。同时确保避免泡沫，将细胞分离到介质中。接下来，将细胞转移到96孔V型底板的孔中。

在500倍重力下离心，在4摄氏度下离心5分钟。在不接触细胞的情况下吸气介质和PBS。用200微升蛋白质和不含血清的PBS至少清洗一次细胞。

在500倍重力下离心，在4摄氏度下离心5分钟。倾斜板以丢弃上流液，在不接触细胞的情况下取出洗涤缓冲液。在此稀释蛋白质和血清无色PBS中的固定可行性染料后，以1比1000的比例，准备一个工作的解决方案。

在每个井中加入50微升稀释染料，然后管头上下混合。在摄氏四度时孵育。同时使用铝箔防止光线 10 至 15 分钟。

然后用150微升的洗涤缓冲液清洗细胞一两次。在此之后，离心机在500倍的重力下，4摄氏度为5分钟，并丢弃上经。要修复细胞，加入100微升新鲜准备的1%甲醛和洗涤缓冲液。

并在4摄氏度下孵育，同时保护10至15分钟的光线。在此之后，用100微升的洗涤缓冲液清洗细胞一次或两次。在500倍重力下离心，在4摄氏度下离心5分钟。

丢弃上一提液，将细胞颗粒重新在70微升的洗涤缓冲液中。通过运行校准珠检查圆度计设置性能和灵敏度后，使用未污染的样品调整正向和侧散射电压，使主组在屏幕上清晰可辨。使用单个染色样品执行手动或自动补偿，确保 EGFP 阳性总体在 DsRed 探测器中泄漏最少，反之亦然。

使用荧光减去一个控件，创建绘图并设置门。接下来，使用未污染的样品调整正向和侧散射电压，使主总体在屏幕上清晰可辨。获取并记录每个样本至少 10，000 个可行的细胞事件。

在此之后，使用流式细胞学数据分析软件分析文本协议中概述的数据。HIV-1、未拼接和拼接产品表达的代表性结果表明，JQ1阳性和Tat，显著增加表达EGFP的细胞比例。表示未复制的成绩单。

JQ1阳性也被认为显著增加表达DSRed的细胞的百分比。将拼接产品的比例提高至与Tat类似的水平。这证实了JQ1阳性打开HIV转录和拼接的能力。

然而，用立体异构体控制JQ1阴性治疗，可消除JQ1对HIV转录和拼接的阳性影响。一旦掌握，这种方法可以单独或组合使用药物进行。测试他们高效协同的能力。

这将导致药物和毒性的降低剂量。每次开发后，该技术为在外体患者样本延迟初级模型中测试高效药物组合铺平了道路。