Этот метод может ответить на вопросы в химии протеина и открытии снадобья как условия стабилизируют протеин? Какие мутации влияют на термостабельность фермента? И какие лиганды связываются с белковой мишенью?
Основными преимуществами этой техники являются то, что она быстро, легко выполняется в стандартной лаборатории и идеально подходит для применения со средней и высокой пропускной способностью. Для подготовки образца белка передача 10 микролитров каждого состояния экрана стабильности в соответствующий колодец 96 пластины с использованием многоканальной пипетки, чтобы сэкономить время. Затем приготовьте один миллилитр примерно один миллиграмм на миллилитр белкового раствора в соответствующей буферной системе.
При выполнении теплового сдвига анализ добавить SYPRO оранжевый краситель в образец белка в окончательной концентрации 20X. Смешайте либо инверсии или краткого вихря. Теперь перенесите 10 микролитров белкового раствора в каждую колодец из 96 хорошо пластин.
Печать и центрифуга 96 хорошо пластины в течение двух минут при 600 раз G, чтобы обеспечить образец белка и компонент экрана смешиваются. Запечатать экран стабильности глубоко хорошо блокировать и хранить экран при четырех градусах по Цельсию на срок до четырех месяцев. Для выполнения эксперимента TSA откройте ящик образца, твердо нажав отступ на правой стороне ящика.
Поместите лоток 96 хорошо в системе RTPCR с хорошо A-one слева. Нажмите на новую кнопку эксперимента, чтобы начать создание эксперимента TSA. Во вкладке «Свойства эксперимента» щелкните опцию Melt Curve, когда вас спрашивают, какой тип эксперимента вы хотите настроить?
Затем нажмите на другой вариант, когда его спросили, какие реагенты вы хотите использовать для обнаружения целевой последовательности? В вкладке Настройка плит, Определите цели и образцы, введите целевое имя, а затем установите Reporter как ROX. И Квенчер, как Нет.
В вкладке Настройка плиты, Назначить цели и образцы вкладку, установить выбрать краситель для использования в качестве пассивной ссылки, как нет. В той же вкладке, назначить каждый колодец из 96 хорошо пластины целевого имени, введенного в предыдущем шаге. Во вкладке Метод бежать удалите шаги до тех пор, пока их не будет в общей сложности три.
Установите первый шаг до 25 градусов по Цельсию, с рампой скорость 100% и время пять секунд. Установите второй шаг до 95 градусов по Цельсию, с пандусом скорость 1%и время одной минуты. Наконец, установите третий шаг к 95 градусов по Цельсию со скоростью рампы 100% и время пять секунд.
Выберите для сбора данных с помощью сбора данных падение вниз меню или нажав на значок сбора данных. Установите объем реакции на колодец до 20 микролитров. Нажмите кнопку Start Run, чтобы начать эксперимент TSA.
NanoDSF может быть использован для зондирования тепловой стабильности белка без использования внешних красителей. Образцы могут быть подготовлены в 96 хорошо пластин, как описано ранее в протоколе, но без добавления каких-либо SYPRO оранжевый краситель. Откройте ящик образца, нажав кнопку Open Drawer.
Убедитесь, что оборудование чистое, обращая особое внимание на любую пыль возле образца стойки. Если система имеет обратно рассеяния зеркало очистить его с помощью этанола и ворса свободной ткани. Загрузите капилляры примерно с 10 микролитров из каждой хорошо из 96 хорошо пластины, касаясь одного конца капилляров в раствор.
А затем поместите капилляр в соответствующие капиллярные держатели образца стойки. Будьте осторожны, чтобы не загрязнять середину капилляров с отпечатками пальцев, поскольку это может помешать флуоресценции показания на протяжении всего эксперимента. Обездвижить капилляры магнитной полосой уплотнения.
Запустите предварительное сканирование, чтобы определить положение и интенсивность каждого капилляра, нажав кнопку Start Discovery Scan во вкладке Discovery Scan. Увеличьте или уменьшите силу возбуждения инцидента с начальной мощности в 10%до пика каждого капиллярного сканирования между 4000 и 12 000 единиц. В вкладке «Сканирование плавления» сканирование расплава, установив опцию «Температурный склон» до 7,0 градуса в минуту.
Температура начала до 25 градусов по Цельсию. И конец температуры до 95 градусов по Цельсию. Затем запустите эксперимент nanoDSF, нажав кнопку Start Melting.
Повторите эти шаги, чтобы подготовить образцы для полного эксперимента. После того, как полный эксперимент настроен, перейдите на вкладку Melting Scan и запрограммируйте сканирование расплава, установив параметр Температурный склон до 1,0 градуса по Цельсию в минуту. Температура начала до 25 градусов по Цельсию.
И конец температуры до 95 градусов по Цельсию. Наконец, запустите эксперимент nanoDSF, нажав кнопку Start Melting. Т м используется в качестве количественного измерения тепловой стабильности белка в бенчмарке для сравнения благоприятствования различных условий.
Здесь показаны результаты образца соляного экрана, оккументирующий термически стабилизирующие свойства хлорида аммония в направлении лизозима. Сравнение значений T m лизозима с экраном pH показывает, что соглашение между TSA и nanoDSF, как правило, хорошо, но nanoDSF показывает тенденцию к выявлению несколько более высоких значений Т м в несколько больших сдвигах Т м, чем TSA. Существует общая тенденция к повышению стабильности с уменьшением значений рН.
Диапазон значений T m, полученных с использованием различных буферных систем с одинаковыми значениями рН, может быть значительным. Для лизозимных комбинаций условий, присутающих наивысшие значения TSA T m с каждого экрана стабильности, были протестированы для зондирования для синергетического комбинированного эффекта. По мере добавления большего числа компонентов буферной системы происходит общее увеличение значений T m.
Заметное синергетическое воздействие может произойти, когда отдельные компоненты буфера оптимизированы и объединены с экранами стабильности. Следуя этому методу, другие методы, такие как кристаллизация могут быть использованы для определения трехмерной структуры белка и разгадать молекулярную основу для связывания лиганда. Помимо того, что мы предоставляем представление о стабильности белка в рамках проекта Virus-X, этот метод применим к широкому спектру систем обнаружения и разработки лекарственных препаратов.
