Биочипы ДНК являются привлекательной исследовательской платформой для самостоятельной ресинтететики биологии, первоначально разработанной группой BASF, которая позволяет ею ею его рода in vitro в течение длительных периодов времени. С помощью этого протокола мы надеемся сделать эту технологию доступной для более широкого круга исследователей. Наш метод, который называют литографией bephore, представляет собой стратегию иммобилизации ДНК на основе реакции смещения нити ДНК.
Сила этого метода заключается в его многоступенчатых литографических возможностях, его простой воспроизводимости и коммерческой доступности всех компонентов. Как и другие решения биочипа, bephore можно сочетать с различными технологиями. Например, функциональные генные щетки могут быть собраны в микро-отсеках для экспрессии белка.
Для начала приготовьте смесь RCA, смешивая пять частей воды с одной частью 30%аммиачного раствора в стеклянном стакане. Нагрейте смесь до 70 градусов по Цельсию на горячей тарелке, помешивая. Как только он достигнет 70 градусов по Цельсию, добавить одну часть 30%перекиси водорода.
Затем поместите кремниевую пластину диаметром 100 миллиметров в раствор, чтобы удалить из него органический материал и частицы. Через 30 минут вынюхайте субстрат, тщательно промойте его водой из бутылки для мытья и высушите азотной пушкой. Немедленно приступайте к PEGylation субстрата.
Для достижения этой цели сначала разбавьте биотин-PEG-silane в сухом толуоле до 5 миллиграммов на миллилитр и вихрем раствор, пока он хорошо перемешан. С субстратом помещается в стеклянную чашку Петри, медленно пипетка раствор на субстрат, охватывающих всю поверхность, но избежать позволяя раствору течь через край. Как только поверхность будет покрыта, закройте чашку Петри, а затем добавьте дополнительную крышку.
Через 30 минут снимите крышку и добавьте в чашку Петри около 40 миллилитров изопропилового спирта. Затем вынюхайте субстрат, тщательно промойте его изопропиловым спиртом и высушите азотным пистолетом. Когда высохнет, хранить субстрат в темноте, пока это не нужно.
Подготовьте субстрат с помощью стеклянного резака или скальпеля, чтобы сформировать один сантиметр на один сантиметр штук. Затем добавьте простую отметку выравнивания, сделав короткую царапину от центра к краю субстрата. Удар любых мелких частиц от чипа с помощью азотной пушки.
Затем смешайте две капли двухкомпонентного силиконового клея и нанесите клей на поверхность чипа, оставив область вокруг кончика царапины пустой. Там клей обеспечивает гидрофобный барьер, сохраняя на чипе акальные растворы. Это облегчает последующие шаги мытья, и уменьшает количество ДНК, необходимое для инкубации.
В более позднем шаге, клей может быть легко очищен. На следующих этапах фотосемаемая ДНК обрабатывается только в условиях желтого света. Обложка чип около 10 микролитров смеси bephore при комнатной температуре, и поместите чип в коробку частично заполнены водой, чтобы уменьшить испарение.
После одного часа, мыть чип несколько раз с PBS, чтобы удалить любые неограниченные смеси bephore. Затем добавьте к чипу 10 микролитров пассивации. Через два часа, мыть чип несколько раз с PBS, чтобы удалить неограниченные пассивации агентов.
Вырежьте печатную фотомысяк до нужного размера, чтобы соответствовать подходящей маске. Вставьте его в положение остановки поля и используйте знаки выравнивания для выравнивания маски в держателе. С помощью субстрата, размещенного на стадии микроскопии, вставьте красный фильтр в траекторию освещения и сосредоточьтесь на поверхности субстрата.
Затем перейдите в область субстрата, который будет выставлен. Затем вставьте держатель маски, заблокив подсветку и перевести на УФ-фильтр. При низкой интенсивности света откройте затвор и используйте камеру, чтобы быстро сфокусировать маску на субстрате.
Теперь, когда субстрат выровнен и маска в фокусе, блокируйте световой путь к камере и осветите субстрат с высокой интенсивностью света в течение желаемого времени экспозиции. После экспозиции удалите образец из микроскопа и аккуратно удалите как можно больше буфера из субстрата, не сушив его. Затем добавьте от 10 до 20 микролитров ДНК с последовательностью для крепления к поверхности.
Поместите субстрат во влажную коробку, чтобы он не высыхал, и инкубировать ДНК на субстрате в течение двух часов при комнатной температуре. Для того, чтобы наблюдать разобщенные экспрессии генов на перевернутый микроскоп, сначала отдельно подготовить две части образца держателя. Начните с склеивания чипа bephore с обездвиженной генной щеткой на держатель чипа, используя двустороннюю клейую ленту.
Затем добавьте вакуумную смазку вокруг центрального отверстия нижней части держателя и вставьте держатель чипа. Теперь соберите верхнюю часть держателя. Вырезать тонкий чип PDMS с отсеками как можно меньше, оставляя канал открытым для одной стороны, чтобы позже обеспечить обмен отходами и молекулами-предшественниками путем диффузии Далее, плазма-лечить стеклянную крышку скольжения в задней стороне чипа PDMS с кислородной плазмой.
Сразу после обработки поместите чип PDMS в центр стеклянной горки, а отсеки будут направлены вверх. Затем выпекать стекло с PDMS в течение одного часа при температуре 70 градусов по Цельсию. Незадолго до сборки всего держателя образца плазма-обработать стеклянную горку с чипом PDMS, как и раньше.
Затем добавьте немного вакуумной смазки вокруг большого отверстия верхнего держателя и поместите стеклянную горку с PDMS на нее. Аккуратно нажмите стекло на смазку. Аккуратно снимите буфер с чипа и вымойте его один раз с помощью 10 микролитров системы саморазмещения.
Затем добавьте на чип 60 микролитров системы саморазмыщения и удалите двухкомпонентный силиконовый клей с краев. Теперь добавьте 20 микролитров системы выражения на PDMS. После размещения капли на PDMS, быстро проверить в стереоскопический микроскоп, что отсеки хорошо мокрые и без пузырьков воздуха.
Если есть пузырьки воздуха, попробуйте смыть их. Чтобы собрать две части держателя, а также выровнять камеры и кисти ДНК, работа под стереоскопическим микроскопом. Обездвижить нижний держатель с рукояткой захвата, так что два винта и wingnuts будет легко доступны обеими руками.
Вставьте верхний держатель в нижний держатель и опустите его до тех пор, пока капли системы выражения без клеток не сливаются. Затем проверьте, чтобы убедиться, что отсеки и знак выравнивания находятся в аналогичной области в плоскости XY. Снизу, винт вверх wingnuts, пока они не коснутся нижней стороне держателя.
При выравнивания отсеков и чипа в плоскости XY, аккуратно затяните wingnuts. Этот шаг требует некоторого опыта и зависит от конструкции держателя образца. PDMS следует нажимать на чип только с мягкой силой.
Затем распылите губку в анти-испарение корпуса с водой, и вставьте держатель в коробку. Затем заполните пятими миллилитровый шприц двухкомпонентным силиконовым клеем и используйте его для уплотнения коробки. Наконец, перенесите коробку в контролируемый температурой микроскоп, и изображение кисти ДНК и реакции с помощью микроскопии флуоресценции.
Двухступный литографический процесс, выполненный здесь на стеклянном слайде bephore, дает перекрывающиеся узоры флуоресцентно помеченных нитей ДНК. В этой демонстрации экспрессии генов на чипе, ДНК обездвижена в камере слева. При воздействии экспрессии смесь, желтый флуоресцентный белок YPet синтезируется из обездвиженой ДНК.
Для оценки активности системы экспрессии генов после отбеливания наблюдается восстановление флуоресценции. В два часа интенсивность флуоресценции быстро восстановилась. Однако, после четырех и шести часов, он не восстановился, что указывает на то, что без свежего питания экспрессии смеси, реакция прекратилась около часа четыре.
Хотя экспрессия генов ограничена в закрытой системе, она может поддерживаться в течение более длительных периодов времени, поставляя отсекам экспрессии дополнительные молекулы-прекурсоры с помощью микрофлюитики. Метод bephore использован для того чтобы обездвижить олигонуклеотиды или дна длины гена, которые можно придать для того чтобы построить системы взаимодействующих кистей дна для выражения re-гена. Техника может также использоваться для других применений в биофизике, таких как исследования флуоресценции одной молекулы.
После просмотра этого видео, вы должны быть в состоянии изготовить биочипы bephore из пластин или стеклянных слайдов, и интегрировать их в свои исследовательские проекты.
