Дифференциация клеток-предшественников сердца, или CPCs, при усилении требует фазового перехода от размножания к совершенной стадии, и этот протокол использует эффективную эндотелианую линию в CPCs. Основным преимуществом этого метода является то, что он применим к КФУ, изолированным на основе нескольких методов и различных видов. Этот протокол может быть использован для повышения терапевтического потенциала КПК для клеточной терапии.
Он также может быть использован для исследования потенциалов и механизмов дифференциации и как они страдают от сердечных заболеваний. CPCs являются неоднородной популяции клеток, которые могут отличаться по форме, размеру и потенции. Таким образом, протокол должен быть скорректирован в соответствии с конкретной субпопуляцией используемых КПК.
После анестезии мыши, протрите ее грудь 70% этанола. Используя ножницы, вырезать кожу и грудную стенку, чтобы разоблачить грудной полости. Используйте типсы, чтобы поднять сердце, а затем использовать ножницы, чтобы сократить его у основания.
Перенесите сердце на блюдо культуры P60, содержащее пять миллилитров холодного PBS, а затем используйте миппы для перекачки сердца и выброса крови из полостей. Поместите сердце в блюдо P60, содержащее пять миллилитров холодного PBS и мыть его. Используйте небольшие ножницы, чтобы удалить атрия, разрезать сердце на две продольные части, и мыть их в пять миллилитров ледяной PBS.
Используя маленькие ножницы, разрежьте кусочки сердца на более мелкие секции. Добавьте каплю сбалансированного соленого раствора Хэнка, содержащего коллагеназу B в концентрации одного миллиграмма на миллилитр, и используйте стерильное лезвие бритвы, чтобы тщательно измельчить маленькие кусочки сердца. Затем добавьте в блюдо 2,5 миллилитров раствора коллагеназы B.
Поместите блюдо под углом 30 градусов в инкубатор при 37 градусах по Цельсию. Пусть рубленые кусочки сердца инкубируют в течение максимум 30 минут, неоднократно проходя их через пастер пипетку каждые 10 минут во время инкубации. Во-первых, добавить пять миллилитров холодного HBSS дополнены 2%FBS в фарш и гомогенизированных частей сердца.
Используя 100-метровый фильтр, фильтруйте кусочки сердца, чтобы удалить любые непереваренные ткани. Центрифуга при температуре 470 Г и при комнатной температуре в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и повторно приостановьте гранулы в пяти миллилитров буфера лиза красных кровяных телец.
Инкубировать на льду в течение пяти минут с редким встряхивания. После этого добавьте 10 миллилитров PBS и отфильтруйте образец через 40-метровый фильтр, чтобы исключить более крупные клетки, включая остаточные кардиомиоциты. Центрифуга при температуре 470 Г и при комнатной температуре в течение пяти минут без перерыва.
Затем повторно приостанавливать клетки в DMEM дополняется 10%FBS, стремясь к окончательной концентрации клеток в один миллион клеток на миллилитр. Распределите клетки на две трубки для окрашивания и сортировки, добавив 1,5 миллилитров клеточного раствора в одну трубку и 3,5 миллилитров во вторую трубку. Добавить раствор Hoechst и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 90 минут с случайным листать, чтобы обеспечить равное распределение красителя и предотвратить свертывание клеток.
Боковое население появляется в низком левом углу Hoechst в стороне от основного населения. В сюжете FACS его можно определить на основе негативного контроля, при котором верапамил побуждает население стороны исчезнуть. Разогреть средний от 1 до 37 градусов по Цельсию и охладить центрифугу до четырех градусов по Цельсию.
Центрифуга сортировать трубки при 470 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение шести минут. Затем повторно приостанавливай клетки в среднем. Перенесите клетки в газоразмещенное блюдо P60, содержащее четыре миллилитров среднего.
Изменение среды каждые три дня, пока клетки достигли слияния между 70 и 80%Культура SP-CPCs в течение двух-трех дней в T75 колбы с использованием восьми миллилитров среднего по одному в каждой колбе. Далее осторожно аспирировать медиум и аккуратно промыть колбу пятью миллилитров теплого HBSS. Лечить клетки с пятью миллилитров трипсина ЭДТА в течение пяти минут при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа.
Затем добавьте пять миллилитров среднего, чтобы остановить активность трипсина, и перенесите подвеску клетки в 15 миллилитровую трубку. Центрифуга при температуре 470 Г в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем повторно приостанавливать клетки в среднем один или средний два.
Плита клетки на P60 блюда, покрытие 250000 SP-CPCs на блюдо с тремя миллилитров среды, содержащей различные концентрации сыворотки. После двух дней культивирования, собирать среду из каждого блюда в 15 миллилитров трубки для сбора мертвых клеток. Трипсинизировать клетки адепта, как описано ранее, и собрать подвеску клетки в 15 миллилитровую трубку, которая содержит собранную среду.
Центрифуга в 840 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре, затем аспирировать супернатант и добавить один миллилитр либо среднего одного или среднего два для подсчета клеток. Пятно SP-CPCs с трипан синий и рассчитывать жизнеспособных и мертвых клеток. Во-первых, аспирировать среды из подготовленных клеток, и промыть их осторожно с пятью миллилитров теплого HBSS.
Лечить клетки с пятью миллилитров трипсина ЭДТА в течение пяти минут в клеточном инкубаторе. Затем добавьте пять миллилитров среднего, чтобы остановить активность трипсина. Перенесите подвеску клетки на 15 миллилитровую трубку и центрифугу при температуре 470 Г в течение пяти минут при комнатной температуре.
Аспирировать супернатант и добавить средний два для подсчета клеток. Далее, семя 80000 клеток в каждый колодец предварительно покрытием шесть хорошо культуры пластины с тремя миллилитров среднего два. Держите пластину на 37 градусов по Цельсию в течение 20 до 24 часов, а затем изменить средний в каждом хорошо до трех миллилитров среднего три.
Культура пластины в течение 21 дней, изменение среды каждые три дня. После этого, пятно клеток с эндотелиальным маркером и выполнять флуоресцентную микроскопию для проверки эндотелиальной природы дифференцированных клеток. Во-первых, аспирировать среду из подготовленных клеток и аккуратно промыть их пятью миллилитров теплого HBSS.
Лечить клетки с двумя миллилитров трипсина ЭДТА в течение пяти минут в клеточном инкубаторе, а затем добавить три миллилитров среднего три, чтобы остановить активность трипсина. Перенесите подвеску клетки на 15 миллилитровую трубку и центрифугу при температуре 470 Г в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант и добавить один миллилитр из средних трех, пипетки осторожно перемешать.
Подсчитайте клетки и семена от 2000 до 4000 клеток в 100 микролитров среднего три к каждой матрице покрыты хорошо 96-хорошо пластины. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 16 часов. После этого используйте ярко-полевой микроскоп в два раза больше, чтобы сфотографировать клетки.
В этом исследовании исследуются подходящие условия для облегчения эндотелиальной линии приверженности клеток-предшественников сердца. Когда слияние клеток находится на уровне или ниже 60%, в образцах, обработанных 3,5%FBS, существенной разницы не наблюдается. Когда клетки при этом слиянии обрабатываются 0,1%FBS, они показывают снижение пролиферации клеток на ламинин по сравнению с фибронектином, но не показывают увеличения смертности клеток.
В отличие от этого, клетки с высоким уровнем слияния не показывают существенной разницы ни в пролиферации клеток, ни в гибели клеток между этими двумя условиями. Изменения в форме клеток, как представляется, являются показателем подходящих культурных условий, в которых эндотелиальная дифференциация будет успешной. В течение семи-14 дней в эндотелиальной среде дифференциации, успешные культуры, как видно, содержат большие клетки с различной морфологией.
Интересно, что эти клетки исчезли к концу фазы дифференциации и, как правило, появляются в более низких количествах и в более поздние моменты времени в культурах высокой плотности. Образование труб последовательно успешно в клетках потрошено на низкой плотности и продифференцировано на ламинине, пока увидено, что главным образом отказ в клетках потрошенных на высокой плотности. В то время как образование труб в основном неудачно в клетках, культурных на фибронектине, независимо от плотности клеток, те, дифференцированные при низкой плотности иногда образуют рудиментарные трубки.
Концентрация сыворотки и плотность клеток для индуцирования эндотелиальной линии имеют решающее значение, и они должны быть скорректированы, чтобы гарантировать замедление пролиферации при сохранении жизнеспособности. После индукции линии, CPCs от людей или доклинкных моделей заболевания могут быть использованы для исследований трансплантации клеток для оценки их потенциала дифференциации in vivo. Этот протокол может помочь в изучении или создании новых инструментов регенерации сердца, и ранее он был использован для изучения молекулярного механизма ранней приверженности линии.
