Общая цель этой процедуры субретинальной инъекции заключается в том, чтобы доставить вектор к сетчатке в минимально инвазивных и воспроизводимым образом, что наблюдается в режиме реального времени. Здравствуйте, этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в исследованиях генной терапии об эффективности доставки вектора и токсичности терапевтического агента. Некоторые преимущества этого метода включают минимальный ущерб сетчатке и другим структурам глаз, точное картирование места инъекций, а также строгие количественные измерения in vivo, которые позволяют получить твердый статистический вывод.
Для внутриглазной инъекции трансгена, первое место анестезированной мыши на стадии просмотра микроскопа системы визуализации сетчатки и поместите кончики стерильных тупых типсов радужной оболочки глаза на 7 и 10 часов позиции века при нажатии миппы открытыми и вниз, чтобы мягко вызвать проптоз. Используйте типсы, чтобы уговорить веки под глазом земного шара и направить кончик иглы примерно на 1 до 1,5 миллиметра ниже края роговицы лимбуса. Затем нанесите каплю стерильного раствора PBS на глаз и накройте глаз стерильным крышкой.
Тщательно ввещайте иглу в глаз через конъюнктиву до тех пор, пока не будет создана склеральная депрессия. Используйте микро-манипулятор, чтобы повернуть глаз вверх, пока склеральная депрессия находится в фокусе, а затем диск иглы вперед, чтобы создать резкий пик в сетчатке с кончиком иглы. Используя держателя иглы, поверните иглу только до тех пор, пока кончик иглы не пронесется через склеру и RPE, позволяя мукеscein в кончике иглы быть видимым под тканью сетчатки в непосредственной близости от подретинального пространства и монослойной клетки пигмента сетчатки.
Привод кончик иглы вниз, так что это касательной к глобусу, а затем активировать насос инъекции с педалью ноги переключатель. После 0,5 к одному микролитера трансгенного раствора был доставлен в подретинального пространства, снять иглу и подтвердить, что кровь стабильна и что жидкость не просачивается из места инъекционного тракта. Чтобы подтвердить успех инъекции, завекомните прямоугольный объем OCT и сравните изображения с изображениями различных видов потенциальных результатов инъекций.
После подтверждения правильного размещения инъекций используйте прямоугольное изображение OCT, чтобы сопоставить размер блеба на изображение fundus. Чтобы сопоставить степень подретинального блеба, откройте прямоугольный объем OCT-изображения блеба таким образом, чтобы узнаваемый ориентир в глазу был включен в изображение. Добавить столько калиперов, сколько необходимо для определения положения левого и правого краев B сканирования, а также оптической головки нерва, ONH, если таковые имеются, и точки перегиба, где сетчатка отделяется от RPE и хороида, а затем сохранить данные.
Затем составить сохраненные файлы и построить данные, эффективно создавая карту инъекции bleb на en face OCT изображения. Наложить на изображение fundus, содержащее место впрыска, и сохранить объединенное изображение. Используйте это изображение, чтобы найти области, представляющие интерес во время последующего изображения OCT.
Чтобы оценить дегенерацию сетчатки после инъекций, сначала откройте записанный спектральный домен с высоким разрешением OCT или HRSD OCT прямоугольное изображение громкости и выберите B-сканирование для измерений. Увеличьте выбранное изображение до тех пор, пока оно не заполнит экран и не нажмете правой кнопкой мыши на изображение. Нажмите на калиперы, чтобы выбрать соответствующее количество калиперов, а затем используйте функцию настройки калипера, чтобы назначить калиперы вертикальными в колонке углового блока и включите расположение дисплея калипера, чтобы облегчить равномерное размещение калипера по всей сетчатке.
Нажмите применить и переместить каждый калипер в соответствующее место от 0,1 до 0,2 миллиметра друг от друга через B сканирования, заботясь, чтобы поместить один калипер в центре головы зрительного нерва, когда это необходимо. Когда все калиперы были размещены, нажмите и перетащите каждого калипера в длину области интересов, произвольно устанавливая калиперы, не накладыв измеримые области сканирования B до максимальной длины. Для измерения толщины внешнего ядерного слоя поместите верхнюю часть каждого калипера на внешнюю ограничивающая мембрану и дно каждого калипера в нижней части внешнего плексиформного слоя с шагом от 0,1 до 0,2 миллиметра по всей сетчатке.
После того, как все калиперы были помещены и скорректированы по размеру, нажмите правой кнопкой мыши на изображении и нажмите сохранить данные калипера ",то повторить измерения, как только что продемонстрировано для каждого десятого B сканирования, сохраняя калиперы открытыми и в том же месте на X-оси и настроить длину калиперов по мере необходимости, не перемещая их в направлении X. Когда все сканирование будет измерено, откройте сохраненные файлы данных и нажмите дату изменения ", чтобы организовать файлы в соответствии с сэкономленным временем. Откройте все файлы для каждого измеренного B-сканирования и соберите необработанные данные из каждого B-сканирования в один файл от самого низкого до самого высокого числа кадров и выберите столбцы данных, включая имя калипера, длину и центр X столбцов.
Убедитесь, что центр X одинаков для всех Сканирований B, измеренных для каждого прямоугольного объема OCT изображения обработаны и удалить любые данные из калиперов, которые не были использованы для записи измерений. Установите калипер, расположенный в центре головы зрительного нерва, до нуля и нарисуй данные для X по сравнению с несколькими наборами данных Y, чтобы получить функцию 3D участка для толщины внешнего ядерного слоя или любого другого измеренного слоя сетчатки. Затем сравните измерения внешнего ядерного слоя между контролем и экспериментальными животными с соответствующим возрастом, чтобы определить скорость и однородность любой потенциальной дегенерации сетчатки.
Для 3D-картирования измерений сетчатки просмотрите изображения OCT после инъекций и обратите внимание на любые идентифицируемые ориентиры, а затем распоистите животное для получения последующего изображения SDO CT из того же региона, заботясь о том, чтобы включить те же идентифицируемые ориентиры, и обработать записанные изображения, как только что продемонстрировано. Очень важно получить высококачественные изображения OCT, которые включают в себя идентифицируемые ориентиры для облегчения переосмысления ранее введенных областей сетчатки. Для того, чтобы измерить изменения в длине ОС, калиперы были помещены из внешней ограничивающей мембраны в мембрану Брукс, что позволяет надежные измерения, поскольку эти слои легко идентифицируются в OCT изображений.
Различия в измерениях между этими слоями от различных линий мыши были отнесены к более коротким длинам внешних сегментов. Если субретинальная инъекция выполняется успешно, открытие подретинального пространства вызывает выработку блеба, который можно четко визуализировать как в представлении hrSD OCT, так и на изображениях сканирования B. Намерие пограничной карты места инъекции позволяет сегментировать измерения тканей сетчатки и наборы данных о положении калиперов, что позволяет последующему статистическому тестированию воздействия конкретных терапевтических агентов на дегенерацию сетчатки.
После освоения, этот метод может быть завершен в течение десяти минут, если выполняется должным образом. При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы сохранить хирургическую среду чистой и стерильной. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области генной терапии для мониторинга всего процесса субретинальной хирургической инъекции в режиме реального времени и создал способ сразу определить хирургический успех in vivo.
После этой процедуры инъекции, OCT и другие методы, такие как электроретинография может быть выполнена, чтобы ответить на дополнительные вопросы о трансгенного функционального спасения и / или токсичности. После просмотра этого видео, вы должны иметь понимание того, как выполнять трансклералевидные и трансхороидальные подретинальные инъекции, как сопоставить степень инъекции bleb на OCT от этого изображения, и получить строгие измерения внешних слоев сетчатки. Не забывайте, что работа с векторами генной терапии может быть опасной и что меры предосторожности, такие как ношение соответствующего средства индивидуальной защиты, всегда должны использоваться при выполнении этой процедуры.
