Идентификация ингибиторов PD-1/PD-L1 с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса

В данном протоколе описан анализ блокады ингибиторов PD-1/PD-L1 с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса. Он использует двухступенчатую стратегию иммобилизации и специализированную буферную систему для точного измерения единиц реагирования, облегчая оценку скорости блокады для соединений или биологических препаратов. Кроме того, он поддерживает высокопроизводительную идентификацию ингибиторов PD-1/PD-L1.

Нарушение взаимодействия PD-1/PD-L1 является перспективной стратегией иммунотерапии рака. Надежные платформы скрининга имеют важное значение для оценки эффективности ингибиторов PD-1/PD-L1. Ранее проведенный анализ блокады PD-1/PD-L1 человека с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (платформа для скрининга ингибитора PD-1/PD-L1 первого поколения) продемонстрировал результаты, сопоставимые с результатами, полученными с помощью гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF) и клеточных анализов, с потенциалом для крупномасштабного скрининга. В данной работе представлена оптимизированная версия этого анализа (платформа для скрининга SPR ингибитора PD-1/PD-L1 второго поколения), отличающаяся двухступенчатым процессом сопряжения, сочетающим связь амина и биострептавидина для улучшения контроля ориентации PD-1 на чипе и снижения потребления белка PD-1. Обновленная платформа была успешно валидирована с использованием ингибитора PD-1/PD-L1 BMS-1166, показав блокадные эффекты, сравнимые с предыдущим методом на основе SPR и другими известными методами, такими как ИФА. Эти результаты подтверждают надежность подхода. Эта оптимизированная платформа скрининга SPR предлагает высокопроизводительный и надежный инструмент для выявления новых ингибиторов PD-1/PD-L1, продвижения исследований в области иммунотерапии рака и выявления потенциала SPR в скрининге ингибиторов контрольных точек иммунного ответа.

Препараты блокады контрольных точек иммунного ответа, особенно те, которые нацелены на программируемую гибель клеток-1 (PD-1) и лиганд запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-L1), находятся на переднем крае стратегий иммунотерапии рака. Анти-PD-1/PD-L1 терапия получила одобрение для использования при различных типах рака, таких как гематологический, кожный, легочный, печеночный, мочевого пузыря и почечный рак¹. PD-1 представляет собой трансмембранный гликопротеин, принадлежащий к суперсемейству иммуноглобулинов, характеризующийся одним вариабельным (IgV) доменом на N-конце, примерно 20-аминокислотным стеблем, отделяющим домен IgV от плазматической мембраны, трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, содержащим сигнальные мотивы на основе тирозина². PD-L1, идентифицированный как один из лигандов для PD-1, представляет собой трансмембранный белок I типа, обладающий трансмембранной областью, двумя внеклеточными доменами — иммуноглобулиновой константой (IgC) и IgV, а также относительно коротким цитоплазматическим доменом, который запускает внутриклеточные сигнальные пути³. Ингибирующий путь PD-1/PD-L1 служит важнейшей иммунной контрольной точкой, регулирующей активацию Т-клеток и аутоиммунитет⁴. PD-1 экспрессируется на Т-клетках, где он взаимодействует с PD-L1, ингибирует передачу сигналов рецепторов Т-клеток и блокирует стимуляцию молекул CD28 и CD80 на антигенпрезентирующих клетках и Т-клетках5. Раковые ткани используют этот физиологический механизм, сверхэкспрессируя PD-L1 во время фазы побега, тем самым создавая иммуносупрессивную среду, способствующую росту и прогрессированию опухоли⁶. Ингибиторы PD-1 и PD-L1 нарушают это взаимодействие, позволяя иммунной системе уклоняться от индуцированного опухолью подавления и повторно инициировать процесс опосредованной Т-клетками опухолевой гибели⁷.

Основываясь на фундаменте, заложенном выдающейся ролью терапии блокады иммунных контрольных точек, разработка ингибиторов PD-1/PD-L1 ознаменовала значительный прогресс в иммунотерапии рака. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило девять ингибиторов иммунных контрольных точек, которые специально нацелены на путь PD-1/PD-L1. К ним относятся шесть ингибиторов PD-1 - пембролизумаб, достарлимаб, ниволумаб, цемиплимаб, орипалимаб и тислелизумаб - и три ингибитора PD-L1 - атезолизумаб, авелумаб и дурвалумаб ^8,9. Эти методы лечения эффективно используются для лечения различных видов рака, таких как меланома, рак легких, уротелиальный рак, рак шейки матки, рак желудка или желудочно-кишечного тракта и другие^{солидные опухоли}. Несмотря на свою эффективность, терапия на основе моноклональных антител сталкивается со значительными ограничениями, включая низкую частоту ответа, высокую стоимость, длительный период полувыведения, тяжелые побочные эффекты, связанные с иммунитетом, и ограничения на внутривенное или подкожное введение 11,12,13. Следовательно, исследования все больше сосредоточены на разработке низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных на ось PD-1/PD-L1. Эти малые молекулы обладают явными преимуществами, такими как улучшенное проникновение в клетки, модуляция различных биологических мишеней, повышенная биодоступность при пероральном приеме и снижение затрат, с целью достижения сопоставимых терапевтических результатов с меньшим количеством^{побочных эффектов.} Тем не менее, разработка низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных на взаимодействие PD-1/PD-L1, находится на ранних стадиях, в первую очередь из-за отсутствия надежной высокопроизводительной платформы скрининга. Такие платформы необходимы для быстрой оценки обширных библиотек малых молекул и идентификации ведущих соединений для дальнейшей проверки и оптимизации. Преодоление этой проблемы имеет решающее значение для развития иммунотерапии рака.

Технология поверхностного плазмонного резонанса (SPR) широко используется для обнаружения различных биомолекул, включая антигены антител, ферменты, нуклеиновые кислоты и лекарства, и особенно эффективна при скрининге низкомолекулярных лекарств^15,16. В отличие от других биофизических методов, SPR обеспечивает безметочное обнаружение, кинетические данные в режиме реального времени и широкий диапазон обнаружения. В отличие от этого, изотермическая титрательная калориметрия не позволяет получать кинетическую информацию в реальном времени и требует больших объемов образцов, что ограничивает производительность. Микромасштабный термофорез подвержен буферной интерференции и не может предоставить кинетические данные, в то время как биослойная интерферометрия имеет ограничения, зависящие от размера и свойств молекул. Однородная флуоресценция с временным разрешением требует мечения и чувствительна к флуоресцентной интерференции. Мы признаем, что HTRF является еще одной подходящей технологией для изучения ингибиторов PD-1/PD-L1. Одним из неотъемлемых ограничений HTRF, по сравнению с SPR, является гашение флуоресценции, вызванное внешними взаимодействиями с процессом внутримолекулярного возбуждения (например, переносом электронов, FRET и отбеливанием), чувствительность в процессе скрининга лекарственного средства слишком низка из-за малого диапазона окна и интерференции от флуоресцентных библиотечных соединений или биологических белков. Эти особенности делают SPR превосходным инструментом для разработки лекарств. Наши предыдущие исследования показали, что SPR способен определять эффект блокады малых молекул против PD-1/PD-L1, что является преимуществом по сравнению с другими методами, требующими высоких требований к технологии мечения, многоступенчатости, низкой специфичности и высокой^{стоимости в процессе} разработки лекарств.

В этом исследовании представлена оптимизированная платформа на основе SPR, объединяющая двухступенчатый процесс сопряжения, в котором используется связь амина и биострептавидина для улучшения ориентации PD-1 на чипе и минимизации использования белка. Этот обновленный подход был успешно валидирован с использованием ингибитора PD-1/PD-L1 BMS-1166 в качестве положительного контрольного связующего, продемонстрировав блокадные эффекты, сравнимые как с нашим предыдущим методом SPR, так и с другими известными методами, такими как ИФА^19,20. Это не только подтверждает надежность и воспроизводимость нашего протокола, но и иллюстрирует эффективность нашей модифицированной платформы в облегчении высокопроизводительного скрининга ингибиторов PD-1/PD-L1. Включение этапа захвата био-стрептавидина обеспечивает ориентацию белка на сайт, а не случайно, что позволяет снизить концентрацию PD-1 (40 мкг/мл против 10 мкг/мл) и сэкономить средства, позволяя конечному пользователю иммобилизовать стрептавидин (SA) в чип CM5, что является менее дорогой альтернативой коммерчески выпущенным предварительно иммобилизованным чипам SA. Это делает его предпочтительным для крупномасштабного и экономически эффективного скрининга библиотек соединений/пептидов. Несмотря на то, что дополнительные методы характеризации, в том числе in silico, in vitro и in vivo, имеют важное значение для оценки клинического потенциала ингибиторов PD-1/PD-L1 против рака, наша усовершенствованная платформа скрининга на основе SPR выделяется как эффективный инструмент для широкомасштабного скрининга ингибиторов PD-1/PD-L1.

Реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Иммобилизация белка стрептавидина (SA) на чипе CM5

1. Настройте метод иммобилизации на приборе SPR: Открыть/создать шаблон мастера , выберите иммобилизацию, установите тип микросхемы CM5 и количество ячеек потока за цикл равным 1. Проверьте иммобилизованные проточные ячейки 1 и проточные ячейки 2.
   1. Установите Амин в качестве метода обездвиживания. Установите целевой уровень иммобилизованного, концентрацию лиганда: 40 мкг/мл стрептавидина, целевой уровень: 2000 РУ, раствор промывки: 50 мМ NaOH. Затем проверьте Prime перед запуском.
2. Подготовьте следующие пробирки: R2 B1 и R2 C1 - 40 мкг/мл стрептавидина; R2 B2 и R2 C2: 50 мМ NaOH; R2 B3 и R2 C3: EDC; R2 B4 и R2 C4: NHS; R2 B5 и R2 C5: пустые; R2 B6 и R2 C6: Этаноламин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: EDC и NHS активируют карбоксильные группы на чипе CM5, обеспечивая ковалентную связь с аминами на лиганде. Этаноламин используется в качестве блокирующего буфера для предотвращения неспецифического связывания во время иммобилизации.
3. Разведите 20 мл буфера HBS-EP+ 10× в 180 мл деионизированной (DI) воды для приготовления 200 мл 1× проточного буферного раствора HBS-EP+.
4. Добавьте 1 мл воды, не содержащей ДНКазы, к 1 мг стрептавидина и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее разведите раствор стрептавидина до 40 мкг/мл в ацетатном буфере (pH 4,5). Подготовьте набор реагентов Amine Coupling в соответствии с инструкциями производителя и разместите все соответствующие схемы расположения реагентов, как указано в шаге 1.2.
5. Замените микросхему датчика технического обслуживания на микросхему CM5, затем поместите трубку A в подготовленный буфер 1× HBS-EP+, снова откройте метод иммобилизации и вставьте трубки в соответствии с схемой шага 1.2. Запустите метод и сохраните файл результатов.
6. Техническое обслуживание после запуска: замените микросхему CM5 на микросхему датчика обслуживания, поместите трубку A в бутылку, наполненную деионизированной водой, и запустите праймер. После извлечения чипа CM5 промойте чип несколькими каплями воды DI и высушите на воздухе. Поместите чип в пробирку объемом 50 мл при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иммобилизованный SA позволяет чипу CM5 функционировать как чип SA.

2. Иммобилизация белка PD-1 на SA-чипе

1. Задайте метод иммобилизации на приборе SPR: Открыть/новый шаблон мастера , выберите иммобилизацию, установите тип микросхемы SA и подайте ячейки за цикл равным 1. Проверьте иммобилизованную проточную ячейку 1 и ячейку 2.
   1. Установите SA-биотин в качестве метода. Для ячейки 1 установите холостую иммобилизацию, для ячейки 2 установите цель для иммобилизованного уровня, 10 мкг/мл PD-1 в качестве лиганда, целевой уровень: 4000 RU, затем проверьте прайм перед запуском.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте следующие пробирки - R2 B1 и R2 C1: 1 М NaCl, 50 мМ NaOH; R2 B2 и R2 C2: 50% изопропанола/50 мМ NaOH/1 М NaCl; R2 C3: 10 мкг/мл PD-1.
2. Растворите 58,44 мг NaCl в 1 мл 50 мМ раствора NaOH для приготовления 1 М раствора NaCl и 50 мМ раствора NaOH. Растворите 58,44 мг NaCl и 4,0 мг NaOH в 500 мкл воды, затем добавьте 500 мкл изопропанола для приготовления 50% раствора изопропанола/50 мМ NaOH/1 М NaCl.
3. Приготовьте раствор PD-1: Добавьте 200 μл воды, не содержащей ДНКазы, к 100 μг биотинилированного человеческого PD-1 (Fc и Avitagged) и стабилизируйте при комнатной температуре в течение 30 минут, затем разбавьте до 10 μг/мл в ацетатном буфере (pH 5,0).
4. Разместите все раскладки реагентов, как описано в шаге 2.1. Поместите пробирку A в 1× буферный раствор HBS-EP+, затем извлеките микросхему датчика обслуживания и вставьте микросхему SA (микросхему CM5, покрытую белком стрептавидина из этапа 1). Снова откройте метод иммобилизации, вставьте штатив для реагентов 2 и проверьте положение, затем запустите метод для расчетного времени выполнения.
5. Повторите шаг 1.6.

3. Разведка регенерации для PD-1 и PD-L1

1. Настройте метод скаутинга регенерации: Откройте/новый шаблон мастера , выберите Скаутинг регенерации, установите путь потока: 2-1, 4-3, тип чипа на SA, проверьте цикл кондиционирования запуска, запишите решение как HBS-EP+, время контакта как 30 с, количество впрысков как 3, раствор как PD-L1, время контакта: 30 с, расход: 30 мкл/мин.
   1. Для параметров регенерации расход составляет 30 мкл/мин, а период стабилизации – 300 с. В плане эксперимента установите количество условий равным 4, а количество циклов для каждого условия — 2. Установите условия 4, раствор для регенерации: Глицин 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, время контакта: 30 с, затем проверьте прайм перед запуском.
2. Установите концентрацию PD-L1 в виде отдельной лунки для образца в 96-луночной схеме микропланшетов: R1 A1 до R1 A9: 1 мкМ PD-L1; R1 A10 - R1 A12: буфер HBS-EP+; R1 B1: глицин 1,5; R1 B2: Глицин 2; R1 B3: Глицин 2,5; R1 B4: Глицин 3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве буфера для регенерации используется глициновый буфер с различным рН.
3. Приготовьте раствор PD-L1: Добавьте 200 мкл воды, не содержащей ДНКазы, к 100 мкг белка PD-L1 Fc Tag человека (9,42 мкМ), затем разбавьте до 1 мкМ в буфере HBS-EP+.
4. Поместите все соответствующие реагенты в схему, как описано в шаге 3.2. Поместите трубку A в буфер 1× HBS-EP+, затем замените микросхему датчика обслуживания на микросхему SA. Снова откройте метод Regeneration Scouting , следуйте положению пробирки, указанному на шаге 3.2, вставьте штатив для реагентов, а затем запустите метод для расчетного времени выполнения.
5. Повторите шаг 1.6.

4. Валидация взаимодействия PD-1/PD-L1

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки достоверности ранее опубликованный отчет¹⁸ был дополнен незначительными корректировками.

1. Используйте те же параметры, что и в опубликованном отчете, в разделах «Общие настройки», «Этапы анализа» и «Типы циклов», установите время контакта на 60 с, время диссоциации на 60 с и расход на 30 мкл/мин. В разделе Переменные метода, Переменные оценки и Команды используйте ту же настройку, за исключением использования Глицина 2.0 в качестве Регенерации, установите скорость потока до 30 мкл/мин, проходит через путь потока 1, 2, 3, 4.
   1. Затем настройте прогон и выберите путь потока: 2-1, 4-3. Введите PD-L1 с концентрациями от 0 мкМ, 0,037 мкМ, 0,111 мкМ, 0,333 мкМ и молекулярной массой 51 300 Да. Проверьте все этапы анализа для проверки и выберите простое число перед запуском.
   2. Затем установите концентрацию каждого PD-L1 в качестве отдельной пробоотборной лунки на схеме штатива для реагентов 2: R2 B1: PD-L1 0 μM; R2 B2: PD-L1 0,037 мкМ; R2 B3: PD-L1 0,111 мкМ; R2 B4: PD-L1 0,333 мкМ; R2 A1: Глицин 2.0 в качестве буфера для регенерации; R2 A2: HBS-EP+ в качестве буфера запуска.
2. Приготовьте 200 мл 1× проточного буферного раствора HBS-EP+. Готовьте концентрации PD-L1: разбавляйте белок PD-L1 в концентрациях от 9,42 мкМ до 0,333 мкМ, 0,111 мкМ и 0,037 мкМ в HBS-EP+. Затем поместите все соответствующие реагенты в схему, как описано в шаге 4.1.2.
   1. Вставьте трубку A в буферный раствор 1× HBS-EP+, извлеките микросхему датчика технического обслуживания и вставьте микросхему SA. Снова откройте метод скаутинга регенерации , следуйте положению пробирки, описанному на шаге 4.1, вставьте штатив для реагентов 2 и запустите метод в течение расчетной продолжительности.
3. Повторите шаг 1.6.

5. Анализ PD-1/PD-L1 блокады с низкомолекулярным ингибитором: BMS-1166

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа блокады был составлен ранее опубликованный отчет¹⁸ с незначительными корректировками.

1. Используйте те же параметры, что и в опубликованном отчете, в разделах «Общие настройки», «Этапы анализа» и «Типы циклов», установите время контакта на 60 с, время диссоциации на 60 с и расход на 30 мкл/мин. В переменных метода, переменных оценки и командах также используется одна и та же настройка, за исключением использования Глицина 2.0 в качестве регенерации, настройка расхода до 30 мкл/мин, проходит по пути потока 1, 2, 3, 4.
   1. Затем настройте запуск и выберите путь потока: 2-1, 4-3. Введите образец раствора: PD-L1 (0,111 мкМ, молекулярная масса 51 300 Да) с BMS-1166 в концентрации 0 мкМ, 0,125 мкМ, 0,625 мкМ, 3,125 мкМ. Проверьте все этапы анализа для проверки и выберите простое число перед запуском.
   2. Затем установите концентрацию каждого PD-L1 в виде отдельной пробоотборной лунки в макете штатива для реагентов 2: R2 B1: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0 μM R2 B2: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0,125 μM; R2 B3: PD-L1 (0,111 мкМ) + BMS-1166 0,625 мкМ; R2 B4: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 3,125 μM; R2 A1: Глицин 2.0 для регенерации.
2. Приготовьте 200 мл 1× проточного буферного раствора HBS-EP+. Приготовьте смесь BMS-1166/PD-L1: Растворите 5 мг BMS-1166 в 77,99 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) до получения 100 мМ исходного раствора. Разбавляют исходный раствор белком PD-L1 (0,11 мкМ) до целевых концентраций BMS-1166 при 0 мкМ, 0,125 мкМ, 0,625 мкМ и 3,125 мкМ в HBS-EP+. Разместите все соответствующие раскладки реагентов, как описано в шаге 5.1.2.
   1. Поместите трубку A в буферный раствор 1× HBS-EP+, затем извлеките микросхему датчика обслуживания и вставьте микросхему SA. Снова откройте метод скаутинга регенерации , следуйте положению пробирки из 5.1 и вставьте штатив для реагентов 2, затем запустите метод для расчетного времени работы.
3. Повторите шаг 1.6.

Иммобилизация SA на чипе CM5
Данные были проанализированы с помощью выходных данных прибора SPR и соответствующего аналитического программного обеспечения, указывающих на успешное достижение целевого значения RU (2000 RU) белка SA на проточной ячейке 1 и прото...

За последние несколько десятилетий различные подходы к иммунотерапии, включая противораковые вакцины, ингибиторы контрольных точек иммунного ответа и терапию CAR T-клетками, значительно продвинули^{вперед лечение} рака. Иммунные контрольные точки играют р?...

Авторам нечего раскрывать.

Авторы отдают должное основному объекту RI-INBRE в Университете Род-Айленда, поддерживаемому грантом P20GM103430 от Национального центра исследовательских ресурсов (NCRR), входящего в состав Национальных институтов здравоохранения (NIH). Это исследование было поддержано премией пилотного гранта от Фармацевтического колледжа Университета Род-Айленда, премией за малый грант от Центра наук о жизни Род-Айленда (RILSH) и грантом Фонда Род-Айленда, все они были присуждены Чанг Лю, доктору философии.