Гетеротопическая вспомогательная модель трансплантации цельной печени крысы с использованием гепатикоуретеростомии для исследований отторжения аллотрансплантата

Описанный здесь протокол гетеротопной вспомогательной трансплантации печени крыс представляет собой практический исследовательский инструмент для изучения механизмов отторжения печеночного аллотрансплантата. Эта модель помогает облегчить хирургические препятствия и стресс у животных, связанные с ортотопической трансплантацией печени у крыс.

Модели трансплантатов мелких животных незаменимы для исследований толерантности органов, изучающих возможные терапевтические вмешательства в доклинических исследованиях. В протоколах трансплантации печени крыс (LTx) обычно используется ортотопическая модель, при которой родная печень реципиента удаляется и заменяется донорской печенью. Эта технически сложная хирургическая процедура требует передовых навыков микрохирургии и еще больше осложняется длительным периодом обезболивания и ишемии нижнего тела. Это послужило толчком к разработке менее сложного гетеротопического метода, который может быть выполнен быстрее без времени на обезболивание или ишемию нижнего тельца, снижая послеоперационный стресс для животного-реципиента.

Этот гетеротопический протокол LTx включает в себя два основных этапа: иссечение печени у донорской крысы и трансплантация всей печени крысе-реципиенту. Во время иссечения донорской печени хирург перевязывает надпеченочную полую вену (СГВЦ) и печеночную артерию (ГК). На реципиентной стороне хирург удаляет левую почку и располагает донорскую печень с воротной веной (ВП), инфрапеченочной полой веной (ИГВЦ) и желчным протоком обращенными к почечным сосудам. Далее хирург анастомозирует почечную вену реципиента из конца в конец с ИГВЦ печени и артериализирует ПВ с почечной артерией с помощью стента. Гепатикоуретеростомия используется для дренирования желчных путей путем анастомозирования желчного протока к мочеточнику реципиента, что позволяет выводить желчь через мочевой пузырь.

Средняя продолжительность трансплантации составила 130 минут, холодовая ишемия – около 35 минут, теплая ишемия – менее 25 минут. Гистология гематоксилина и эозина вспомогательной печени из сингенных трансплантатов показала нормальную структуру гепатоцитов без существенных изменений паренхимы через 30 дней после трансплантации. Напротив, 8-дневные образцы аллогенных трансплантатов после трансплантации продемонстрировали обширную лимфоцитарную инфильтрацию с индексом активности отторжения по схеме Банфа 9. Таким образом, этот метод LTx способствует созданию модели отторжения низкой заболеваемости, альтернативной ортотопическому LTx.

LTx мелких животных является бесценной моделью для исследования механизмов отторжения печени. Гетеротопная трансплантация вспомогательной печени с артериализацией воротной вены (HALT-PVA) у крыс была введена в 1968 году Ли и Эджингтоном¹, когда они сообщили об использовании почечной вены и артерии реципиента для реваскуляризации трансплантированной вспомогательной печени. Впоследствии Hess et ^al.2 усовершенствовали протокол за счет смягчения функциональной конкуренции между нативной и вспомогательной печенью за счет уменьшения размера нативной и донорской печени наряду с реконструкцией соединения донорского желчного протока, что привело к долгосрочной выживаемости трансплантата. Дальнейшие уточнения были проведены с введением манжетного анастомоза ^3,4, и Schleimer et ^al.5 определили оптимальный диаметр стента для регуляции кровотока с целью получения физиологического портального кровотока и предотвращения гипер- или гипоперфузии трансплантата. Другие исследователи разработали значительные изменения в методе, используя селезеночную^{6 или общую} подвздошную артерию⁷ для снабжения трансплантата, в то время как некоторые разработали модели, которые использовали только венозную кровь⁸ или только артериальную кровь через печеночную артерию⁹ для снабжения вспомогательного трансплантата печени.

В настоящем исследовании была выдвинута гипотеза о том, что функциональная конкуренция со стороны нативной печени не будет препятствовать отторжению аллотрансплантата, поэтому мы разработали протокол, основанный на модели Шлеймера¹⁰ , регулируемой потоком, который не включал в себя уменьшение размера нативной или вспомогательной печени. Левая сторона реципиента была выбрана для размещения трансплантата, поскольку она обеспечивала оптимальную ориентацию между почечными сосудами реципиента и донорской печенью. Первоначально мы пытались провести реконструкцию желчевыводящих путей с помощью гепатикодуоденостомии, но эти исследования просто подтвердили утверждение Шлеймера о том, что «дренаж желчных путей является ахиллесовой пятой трансплантации печени»¹⁰. Это послужило толчком к разработке новой техники, при которой желчный проток анастомозируется из конца в конец с помощью стента с мочеточником реципиента, что позволяет выводить желчь через мочевой пузырь. Заслуживающим внимания преимуществом использования гепатикоуретеростомии является то, что функциональность печени трансплантата можно ежедневно контролировать, наблюдая за мочой; Печеночный трансплантат, вырабатывающий желчь, окрашивает мочу в ярко-желтый цвет. На рисунке 1 представлен схематический обзор метода HALT-PVA.

Важным преимуществом гетеротопического LTx по сравнению с ортотопическим крысом является отсутствие какого-либо времени на ангепатическую или тотальную ишемию нижнего тела, что позволяет быстрее и легче выздоравливать гетеротопическим реципиентам. Кроме того, иммунологические исследования LTx с использованием ортотопических методов часто полагаются на тяжелое отторжение или смерть реципиента в качестве экспериментальной конечной точки, чего нельзя сказать о гетеротопических трансплантациях, когда животное остается здоровым, даже если аллотрансплантат перестает функционировать из-за отторжения. Обе эти особенности гетеротопического метода поддерживают принципы международной инициативы 3R (Replacement, Reduction, and Refinement)¹¹, которая продвигает основу для минимизации боли, страданий и дистресса, испытываемых исследовательскими животными, и улучшения их благополучия.

Представленная здесь модель HALT-PVA является практичным и надежным методом изучения механизмов отторжения печеночного аллотрансплантата в доклинических исследованиях. Этот полезный экспериментальный метод помогает преодолеть значительные хирургические требования и стресс у животных, вызванный ортотопическим LTx у крыс. В будущем мы намерены использовать этот метод для изучения механизмов острого иммунного отторжения, а также для изучения новых мишеней и терапевтических стратегий для подавления отторжения печеночного аллотрансплантата.

Животные были выращены и содержались в специальных условиях, свободных от патогенов, в учреждениях по уходу за животными в Институте медицинских исследований Висконсинского университета (UW) в Мэдисоне в соответствии с институциональными рекомендациями. Протокол исследования (No M006022) был одобрен Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Школе медицины и общественного здравоохранения Вашингтонского университета, и со всеми животными обращались этично.

1. Животные

1. В качестве доноров используют взрослых самок крыс Льюиса весом 205-235 г и самцов Льюиса весом 250-280 г. В качестве реципиентов используют взрослых самцов норвежских крыс Льюиса и Брауна весом 365-420 г.
2. Выполняйте сингенные трансплантации путем пересадки доноров Льюиса реципиентам Льюиса, в то время как аллогенные трансплантации использовали доноров Льюиса, пересаженных реципиентам Brown Norway.
3. Выполняйте все операции вдвоем с помощью двухголовочного микроскопа.

2. Процедура заготовки вспомогательного донора печени

1. Обезболить крысу-донора ингаляцией 5% изофлурана в индукционной камере. Запишите вес крысы и побрейте живот с помощью электрической машинки для стрижки.
2. Расположите крысу в лежачем положении на подогреваемой операционной подушке носом в конусе для анестезии и иммобилизуйте конечности с помощью ленты. Продезинфицируйте брюшную полость 75% спиртом и опустите изофлуран до 2%.
3. Сделайте продольный разрез кожи по средней линии и мышц от лобка до мечевидной кости с помощью ножниц. Вблизи средней точки продольного разреза распространите его в боковом направлении влево и вправо, затем установите ретракторы по обе стороны брюшной стенки и мечевидного отростка.
4. С помощью влажных ватных тампонов втяните кишечник к левой стороне живота, одновременно с помощью пружинных ножниц разрежьте желудочно-кишечные связки, прикрепленные к печени, затем обездвижьте кишечник под увлажненной марлей. Накройте печень небольшим кусочком стерильной марли, смоченной в теплом физрастворе.
5. С помощью влажных ватных тампонов втяните печень и рассеките серповидные, треугольные, гепатогастральные и гепатодуоденальные связки. Далее прижгите биполярными щипцами и разделите околопищеводные сосуды между левой боковой и передней хвостатой долей.
6. С помощью угловых щипцов или иглодержателей рассеките позади SHVC, расположенного ниже диафрагмы, затем проденьте шелковый шов 5-0 под SHVC и свободно завяжите двойной узел для последующего использования.
7. Втяните нижнюю правую боковую долю вверх, разрежьте связку и обездвижьте под увлажненной марлей. Изолируйте IHVC от забрюшинной ткани вниз до правой почечной вены и перевязайте правую надпочечниковую вену шелковым швом 6-0 как можно ближе к IHVC. Разделите эту вену позже, когда трансплантат будет удален.
8. С помощью гидродиссекционной иглы 27 G (рис. 2A) диссоциируйте PV от окружающей соединительной ткани и отделите ее от пилорических и селезеночных вен путем лигирования и разделения их с помощью шелкового шовного материала 7-0.
9. Изолируйте, перевяжите шелковым швом 6-0 и разделите общую печеночную артерию рядом с тем местом, где она проходит под PV.
10. Перевязать желчный проток шелковым швом 5-0 в месте разветвления гастродуоденальной артерии с максимальным сохранением жировой ткани вокруг желчного протока; В частности, избегайте отделения желчного протока от собственной печеночной артерии, сохраняя при этом общую длину как можно короче.
11. С помощью пружинных ножниц сделайте небольшой разрез в стенке желчного протока проксимальнее места перевязки. Вставьте стент из полиимидной трубки диаметром 0,0215 дюйма и длиной 5 мм в просвет желчного протока и закрепите его шелковым швом 6-0, оставив один конец шва длинным для последующего использования. Разделите желчный проток, разрезав между лигациями 5-0 и 6-0.
12. Отметьте верхнюю сторону IHVC и PV хирургическим красителем, чтобы помочь выровнять сосуды во время анастомоза, затем зажмите воротную вену зажимом для микрососудов как можно дальше от печени.
13. Ввести шприц объемом 20 мл с иглой 26 G в ФВ, проксимальную к микрозажиму, и перфузировать печень 10-15 мл ледяного гепаринизированного физиологического раствора; одновременно разделить IHVC с помощью пружинных ножниц как можно ближе к правой почечной вене.
14. Иссекайте печень с помощью пружинных ножниц, рассекая ПВ проксимальнее микрозажима, затягивая шов 5-0, ранее наложенный вокруг SHVC, и рассекая диафрагму для разрезания внутригрудной полой вены.
15. Продолжайте рассекать оставшиеся связки в задней части печени и разделяйте ранее перевязанную вену надпочечника. Вырезанную печень поместить в холодный солевой раствор на лед.

3. Процедура вспомогательной трансплантации печени реципиенту

1. Обезболить крысу-реципиента ингаляцией 5% изофлурана в индукционной камере. Запишите вес крысы и побрейте живот с помощью электрической машинки для стрижки.
2. Расположите крысу в лежачем положении на подогреваемой операционной подушке носом в конусе для анестезии и иммобилизуйте конечности с помощью ленты. Нанесите лубрикант для глаз, продезинфицируйте брюшную полость 75% спиртом и снизьте уровень изофлурана до 2%.
3. С помощью ножниц сделайте продольный разрез кожи и мышц по средней линии от лобка до мечевидной кости, затем установите ретракторы по обе стороны от брюшной стенки.
4. С помощью влажных ватных тампонов втяните кишечник к правой стороне живота и накройте их увлажненной марлей. Наложите еще одну влажную марлю, чтобы покрыть желудок, селезенку и печень, обнажив левую почку и почечные сосуды.
5. С помощью гидродиссекционной иглы 27 г и тупых щипцов отделите левую почечную вену от почечной артерии, осторожно удалив жир и соединительную ткань из обоих сосудов.
6. Изолируйте гонадные и надпочечниковые вены и используйте шелк 6-0, чтобы временно перевязать их проксимальнее почечной вены. Прижгите с помощью биполярных щипцов все микробоковые ветви, изолирующие почечную вену и артерию между аортой/VC и почкой.
7. Мобилизуйте и перевязайте мочеточник шелковым швом 6-0 на нижнем полюсе. Отметьте почечную вену и артерию хирургическим красителем, чтобы помочь сориентировать сосуды во время анастомоза и убедиться в отсутствии перекручиваний.
8. Зажмите почечную артерию и почечную вену зажимом микрососуда как можно ближе к аорте и ВК. Пересеките почечную артерию пружинными ножницами сразу за разветвлением сосуда и разделите почечную вену примерно на полпути между ВК и почкой. Мобилизуйте левую почку из окружающей соединительной ткани и удалите ее.
9. Промойте оба сосуда гепаринизированным физиологическим раствором с помощью гидродиссекционной иглы 27 G, чтобы удалить всю оставшуюся кровь.
10. Пружинными ножницами вырежьте небольшое отверстие для рта рыбы в развилке бифуркации почечной артерии, чтобы сделать воронкообразное отверстие, и вставьте стент, срезанный 8 мм от катетера 26 G (рис. 2B). Закрепите стент шелковым швом 6-0, оставив один конец шва длинным для последующего использования.
11. Введите донорскую печень и расположите ее так, чтобы ВП, ИГВК и желчный проток были обращены к левой почечной вене и артерии реципиента. Используя нейлоновый шов 9-0, установите два швов на противоположных сторонах соединения IHVC с почечной веной.
12. Сравните ширину сосудов и сделайте небольшой разрез во рту рыбы с помощью пружинных ножниц в лицевую сторону почечной вены до тех пор, пока она не станет шириной, аналогичной IHVC донора (рис. 2C).
13. С помощью нейлонового шва 9-0 анастомозируйте IHVC печени вконец в конец к почечной вене с 9 или 10 идущими швами как на передней, так и на задней стенках сосуда. В качестве альтернативы можно использовать метод манжеты для завершения этого анастомоза ^3,4.
14. Убедитесь, что почечная артерия расположена ниже IHVC (рисунок 2D), и вставьте стент, ранее размещенный в почечной артерии, в воротную вену печени и закрепите шелковым швом 6-0, оставив один конец шва длинным для прикрепления к противоположной нити на артерии. Сведите концы вместе, чтобы каждый из них не соскользнул со стента.
15. Сначала снимите микрозажим на почечной вене, затем снимите микрозажим на почечной артерии.
16. Во время реперфузии печени используйте марлю и ватные тампоны для легкого давления вокруг области анастомоза до тех пор, пока не будет достигнут патентованный анастомоз (Рисунок 2D). Удалите временные перевязки, ранее наложенные на вены надпочечников и гонад.
17. Осторожно мобилизуйте примерно на 10 мм вниз по концу левого мочеточника от окружающей соединительной ткани, оставляя прикрепленное значительное количество жировой ткани. Пружинными ножницами сделайте небольшой разрез в стенке мочеточника проксимальнее ранее поставленной перевязки 5-0.
18. Ранее прикрепленный к желчному протоку полиимидный стент вставить в небольшой разрез, сделанный в стенке мочеточника. Закрепите шелковым швом 6-0 и завяжите один конец длинной нитью со стороны желчного протока стента, плотно стянув оба конца.
19. Верните кишечник в исходное положение (рисунок 2E), промойте 2-3 мл физиологического раствора и закройте брюшную полость в два слоя с помощью 3-0 шелковых беговых швов.
20. Введите 0,1 мг/кг бупренорфина подкожно, поместите реципиента в чистую, отапливаемую клетку и наблюдайте за восстановлением в течение 1-2 часов, прежде чем вернуть животное в помещение для содержания животных.

4. Послеоперационное наблюдение

1. Начиная со 2-го дня после операции, ежедневно вводите реципиентам аллогенного трансплантата гепарин (1 МЕ/г) подкожно.
2. Начиная со 2-го дня после операции, вводите реципиентам сингенного трансплантата гепарин (1 МЕ/2 г) подкожно через день.

В настоящее время для создания протокола HALT-PVA было использовано 29 пар крыс, 17 сингенных трансплантатов и 12 аллогенных трансплантатов. Сингенная трансплантированная печень дожила до назначенной 8 или 30-дневной экспериментальной конечной точки с вероятностью 70% успех?...

Трансплантация печени является единственным вариантом лечения пациентов с терминальной стадией заболевания печени, ежегодно^{в США проводится} почти 9000 LTx. К сожалению, иммунологическое отторжение наблюдается у 25% реципиентов LTx, и это отторжение наносит у...

Авторам нечего раскрывать.

Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения (NIH) K08AI155816, присужденным DA.