Борьба с личинками комаров Aedes albopictus с Carpesium abrotanoides L.

Использование растения Carpesium abrotanoides L. для борьбы с личинками комаров может эффективно сократить популяцию комаров Aedes albopictus и обеспечить основу для разработки инсектицидов растительного происхождения.

Являясь жизненно важным переносчиком лихорадки денге, желтой лихорадки и других болезней, переносимых комарами, Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) может широко распространяться по всему миру и представлять серьезную угрозу для здоровья населения. На сегодняшний день, учитывая быстро возникающую устойчивость комаров к инсектицидам, разработка новых растительных инсектицидов для борьбы с Ae. albopictus и его снижения является актуальной и крайне важной. Таким образом, для изучения влияния отвара растения C. abrotanoides L. на уничтожение личинок комаров нами была выявлена смертность личинок после обработки отваром в различных концентрациях (60 мг/мл, 120 мг/мл и 180 мг/мл) в течение ряда временных моментов (12 ч, 24 ч, 36 ч и 48 ч). Мы обнаружили, что в течение 24 ч при обработке отваром C. abrotanoides L. 180 мг/мл было убито 92,35% комаров по сравнению с контрольной обработкой. Между тем, 36 ч с 120 мг/мл также может убить более 90% комаров. Кроме того, популяции Carassius auratus подвергались воздействию отвара C. abrotanoides L. в дозе 120 мг/мл в течение 36 ч и не умерли. Оценка смертности показала, что данная концентрация не является вредным уровнем загрязнения окружающей среды. Это исследование дает возможность получить растения-кандидаты, которые могут быть использованы для разработки инсектицидов растительного происхождения. Кроме того, эти методы могут быть изменены и применены к другим видам комаров.

Aedes albopictus, также известный как «азиатский тигровый комар», может распространять различные заболевания, такие как лихорадка денге, лихорадка чикунгунья и болезнь, вызванная вирусом Зика, высасывая кровь человека и животных¹. В связи с широким распространением Ae. albopictus эпидемическая ситуация с болезнями, переносимыми комарами, такими как лихорадка денге, в последние годы становится все более серьезной, представляя серьезную угрозу жизни и здоровью людей во всем^мире2. В настоящее время для большинства болезней, переносимых комарами, не существует эффективной вакцины или специфического терапевтического препарата. Уничтожение комаров химическими инсектицидами по-прежнему является основным средством борьбы с болезнями, переносимыми комарами³. Метод химической борьбы с использованием химических инсектицидов позволяет быстро и эффективно убивать комаров и стал основным средством борьбы с комарами-переносчиками⁴. Тем не менее, долгосрочное и широкомасштабное использование инсектицидов привело к снижению чувствительности Ae. albopictus к инсектицидам и резистентности к инсектицидам, что стало самым большим препятствием в борьбе с болезнями, переносимыми комарами. Поэтому большое практическое значение имеет разработка нового типа инсектицида от комаров, обладающего высокой эффективностью, безопасностью и защитой окружающей среды.

В природе растения являются основными производителями. Насекомые и многие животные питаются растениями. Когда растения страдают от различных «природных и техногенных катастроф», они вырабатывают вторичные метаболиты, чтобы выжить. Эти вещества часто обладают способностью противостоять питанию других организмов, болезням и устойчивости к насекомым. Они не только воздействуют на различных вредителей, но и имеют низкий риск токсичности окружающей^среды5. Carpesium abrotanoides L. — многолетнее травянистое растение рода Carpesium abrotanoides семейства Compositae, также известное как «жаба голубая», «живая трава оленя», «дикий табак» и др. Он широко распространен в Китае и Восточной Азии. Его стебли и листья можно использовать в качестве инсектицидов в этих районах для лечения ссадин и лихорадки⁶. Его плод известен в Китае как «Бэй-Хэ-Ши» и используется для лечения ленточного червя и Ascaris lumbricoides в народной медицине ^7,8. Сообщалось, что растение богато монотерпенами, сесквитерпенами, фенолами и другими характерными компонентами и обладает эффективными фармакологическими эффектами, такими как противовоспалительное, противогрибковое, противопаразитарное, противоопухолевое и противовирусное действие⁷. Недавние исследования показали, что он обладает антифидантационным действием на Spodoptera exigua⁹, контактной токсичностью для Sitophilus zeamais¹⁰, убивающей способностью цистицеркус целлюлозы Taenia asiatica⁸, антифидантной активностью и контактной токсичностью для совки и Plutella xylostella¹¹. Достигнут предварительный прогресс в изучении токсического воздействия C. abrotanoides L. на некоторых паразитов, сельскохозяйственных вредителей и санитарных вредителей, которые могут быть использованы для борьбы с личинками Aedes albopictus.

В данном исследовании обсуждается протокол борьбы с личинками Ae. albopictus с C. abrotanoides L. В этом протоколе отвар C. abrotanoides L. применяли для воздействия на личинок четвертого возраста Ae. albopictus, и личиночная гибель обнаруживалась после обработки отваром C. abrotanoides L. в различных концентрациях (60 мг/мл, 120 мг/мл и 180 мг/мл) в ряд временных моментов (12 ч, 24 ч, 36 ч, и 48 ч). Определение убойного действия отвара C. abrotanoides L. на личинок Ae. albopictus дает новую идею для дальнейшей борьбы с комарами с высокой эффективностью, низкой токсичностью и использованием экологически чистых растительных инсектицидов.

Козья кровь, используемая для кормления самок комаров, была собрана на местной скотобойне в городе Дуюнь, Гуйчжоу, Китай, и использована в соответствии с этическими принципами и правилами Ключевой лаборатории паразитарных заболеваний человека в префектуре Цяньнань, Дуюнь, Гуйчжоу, Китай.

1. Приготовление реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Список оборудования, реагентов и других расходных материалов, используемых в данном протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Экстракция и идентификация C. abrotanoides L.
   1. Соберите целую траву C. abrotanoides L. Целая трава C. abrotanoides L. в этом исследовании была собрана в Саньдушуйском автономном уезде, провинция Гуйчжоу (N: 25.95, E: 107.87) в апреле 2021 года.Фотографии с места сбора C. abrotanoides L. на рисунке 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с распределением ресурсов, лечебными свойствами, структурой тканей и физико-химическими идентификационными характеристиками C. abrotanoides L., идентификация C. abrotanoides L. заключался в следующем: Все растение высотой 30-100 см, с прямостоячими стеблями, много ветвей в верхней части, очередные листья в нижней части стебля, слегка черешковые, овальные листья, 10-15 см длиной и 5-8 см шириной, полные или неравномерно зубчатые, листья в верхней части стебля почти сидячие, длинные овальные, постепенно уменьшается вверх, а голова пазушная, почти сидячая, с поникающими цветками, особым газом, легким вкусом и острым. Растение было идентифицировано как C. abrotanoides L. преподавателями, специализирующимися на традиционной китайской медицине в наших филиалах.
2. C. abrotanoides L. Очистка, сушка и дробление
   1. Удалите загрязнения, такие как опавшие листья и почва, с собранного C. abrotanoides L. и очистите его. Сушите на воздухе в течение 10-15 дней на проветривании или сушите в сухой духовке при температуре 95 °C в течение 6 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе сушки C. abrotanoides L. необходимо перевернуть его, чтобы он мог равномерно высохнуть. Если ткань C. abrotanoides L. не так легко раздавливается в процессе дробления, ее можно снова высушить, а затем измельчить.
3. Приготовление отвара эссенции C. abrotanoides L.
   1. Взвесьте 360 г очищенного порошка C. abrotanoides L. , добавьте 1000 мл дистиллированной воды и отварите на медленном огне (мощность 800 Вт) в течение 2 ч.
   2. Отвар процедите с помощью обычной фильтровальной бумаги, а затем сконцентрируйте в ротационном испарителе, чтобы получилась вытяжка. Разбавьте экстракт дистиллированной водой до 1000 мл и приготовьте C. abrotanoides L.Отвар очищенной воды, содержащий 360 мг/мл исходного лекарственного вещества.
   3. Возьмите 50 мл, 100 мл и 150 мл отвара очищенной воды C. abrotanoides L. и разведите их для приготовления водных отваров, содержащих 120 мг/мл, 240 мг/мл и 360 мг/мл исходных лекарственных материалов, по 150 мл каждый для резервного действия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе кипячения следует хорошо контролировать нагрев. После закипания огонь уменьшали, а жидкость выдерживали при температуре 100 °C и слегка кипятили.

2. Подготовка образцов от комаров

1. Источник комаров
   1. Коллекция личинок Ae. albopictus . В этом исследовании личинки Ae. albopictus были собраны в жилом районе города Дуюнь (N: 26.25, E: 107.52), провинция Гуйчжоу, в августе 2020 года.
   2. В соответствии с распределением, личиночными и взрослыми морфологическими характеристиками Ae. albopictus, идентификация Aedes albopictus была следующей: основание Ctenophora личинок Aedes albopictus имеет тонкую вытяжку; неполное хвостовое седло; дыхательная трубка черная, короткая и толстая; взрослые особи Aedes albopictus — это комары мелкого и среднего размера. Самка комара среднего размера и черного цвета. Среднегрудной щиток имеет белую продольную полосу, обычно постепенно сужающуюся сзади и разветвляющуюся в передней области малого щитка. Сустав стопы имеет основание белого кольца, а весь или большая часть сустава 5 белая. Комары были идентифицированы как Ae. albopictus преподавателями паразитологии и специальности «Комары» в наших филиалах.
   3. Поддерживайте обычную подачу при температуре 25 ± 1 °C и относительной влажности 70% ± 10%, а также используйте люминесцентную лампу мощностью 80 Вт в качестве источника света (свет: темнота = 14 ч:10 ч).
   4. Личинки кормят порошком из куриной печени, а взрослых комаров – 10% сахарной водой.
2. Сбор яиц комаров
   1. Когда личинки Ae. albopictus превратились в куколки, высосите куколки с помощью одноразовой пластиковой пастеровской пипетки и перенесите их в клетку для взрослых комаров.
   2. Через 3-5 дней после появления взрослых комаров самка и самец комаров спариваются. В это время кормите самок комаров кровью в течение 4-8 ч.
      Примечание: Кровь, добавленную с антикоагулянтом, помещали в чашку для культивирования, нагревали теплой водой с температурой 37 °C и накрывали слоем марлевой ткани, чтобы самки комаров могли сосать кровь.
   3. Соберите яйца Aedes albopictus с помощью стаканчика для сбора яиц (домашнего: 300 мл непрозрачного пластикового стаканчика с прямыми стенками, содержащего 250 мл дистиллированной воды, а затем погрузили фильтровальную бумагу наполовину вокруг внутреннего края стаканчика).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца Ae. albopictus могут храниться в течение 3-6 месяцев.
3. Вылупление и кормление комаров
   1. Во время эксперимента Ae. albopictus обычно вылуплялся за 1 неделю до эксперимента. Поместите яйца Aedes albopictus на эмалированную тарелку, добавьте 1000 мл водопроводной воды и дайте ей постоять более 24 часов. Из яиц вылупляются личинки через 1-2 дня.
   2. Личинки линяли раз в 1-2 дня, то есть увеличивались на один возраст. Отбирайте 1000 личинок в конце третьего возраста или в начале четвертого возраста после размножения в течение 2-3 поколений без контакта с какими-либо химическими инсектицидами в лаборатории для проведения испытания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если плотность личинок слишком высока, разделите их на пластины, чтобы личинки могли нормально расти.

3. Определение токсического действия отвара C. abrotanoides L. на личинок Ae. albopictus методом погружения

1. Группировка наборов
   1. Разбить экспериментальную группу: Приготовить отвары C. abrotanoides L. (50 мл) с тремя концентрациями препарата (120 мг/мл, 240 мг/мл и 360 мг/мл).
   2. Заготовка контрольной группы: Используйте дехлорированную воду (домашнюю: водопроводная вода стоит более 24 ч) в том же объеме, что и препарат.
   3. Положительная контрольная группа: Приготовьте препарат дельтаметрин, распространенный химический инсектицид, в конечной концентрации 0,05 мг/мл.
2. Добавление жидких лекарств
   1. Используйте несколько одноразовых пластиковых стаканчиков объемом более 200 мл, и добавьте 35 личинок Ae. albopictus в конце третьего или начале четвертого возраста в 50 мл дехлорированной воды.
   2. В опытную группу добавьте 50 мл C. abrotanoides L. отвара очищенной воды каждой концентрации, осторожно встряхните и равномерно перемешайте до общего объема 100 мл. Конечные концентрации отвара очищенной воды C. abrotanoides L. составляют 60 мг/мл, 120 мг/мл и 180 мг/мл.
   3. В контрольную группу бланка добавьте 50 мл дехлорированной воды до общего объема 100 мл и отметьте ее как контрольную заготовку.
   4. В группу положительного контроля добавить 50 мл раствора дельтаметрина с концентрацией 0,1 мг/мл, осторожно встряхнуть и равномерно перемешать в общем объеме 100 мл до конечной концентрации 0,05 мг/мл и отметить как положительный контроль.
3. Наблюдения
   1. Осторожно перенесите помеченные пластиковые стаканчики в комнату для наблюдения с той же средой кормления и зарегистрируйте гибель личинок Ae. albopictus в каждой экспериментальной и контрольной группах через 12 ч, 24 ч, 36 ч и 48 ч соответственно. Понаблюдайте за мертвыми особями под микроскопом и сравните их с нормальными личинками Ae. albopictus .
   2. В указанном выше моменте наблюдения, если личинки были перемешаны острой тонкой иглой и не смогли убежать или не получили никакой реакции, считайте их мертвыми. Повторите тест три раза.
      Примечание: Если смертность личинок в контрольной группе превышала 20%, результаты теста были недействительными и их необходимо было повторить. Общий подход кратко изложен на рисунке 2.

4. Эксперимент по моделированию на открытом воздухе

1. Применяйте три концентрации отвара C. abrotanoides L. к личинкам Ae. albopictus в условиях открытого грунта, чтобы наблюдать за гибелью личинок. Сравните, есть ли разница между токсическим эффектом и эффектом в лаборатории.
2. Примените три концентрации отвара очищенной воды C. abrotanoides L. к дикому карася в условиях открытого грунта, чтобы увидеть, влияет ли это на рост карася. Это делается для того, чтобы предварительно судить, является ли C. abrotanoides L.Очищенный водный отвар наносит ущерб окружающей среде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации были аналогичны концентрациям, упомянутым на шаге 3.2.2. Используемые временные точки: 12 часов, 24 часа, 36 часов и 48 часов соответственно. О эффекте эксперимента по полевому моделированию судили путем сравнения смертности Ae. albopictus , получавших отвар C. abrotanoides L. в лабораторных условиях и в естественных условиях открытого грунта.

5. Статистический анализ

1. Выразите количественные данные в среднем ± SD, а данные подсчета — в процентах (%).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использованный здесь метод статистического вывода составил p < 0,05, и разница была статистически значимой.
2. Используйте соответствующее программное обеспечение для статистического анализа данных и токсичности трех различных концентраций отвара C. abrotanoides L. для личинок Ae. albopictus , чтобы предварительно определить, какая концентрация отвара имеет наибольшую токсичность для личинок Ae. albopictus .

Здесь целая трава C. abrotanoides L. в этом исследовании была собрана в дикой природе (рис. 1). После идентификации C. abrotanoides L. отвар C. abrotanoides L. получали отварным методом (рис. 2) и готовили в разных концентрациях (60 мг/м?...

В настоящее время Ae. albopictus стал одним из 100 самых инвазивных видов в мире. Согласно статистике Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2020 году на районы Азии, наиболее пострадавшие от Ae. albopictus , будет приходиться примерно 70% глобального бремени^?...

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Мы благодарим доктора Синь-Ру Ван из Университета Миннесоты за проницательные советы и рекомендации. Эта работа была поддержана научно-исследовательским фондом Цяньнаньского медицинского колледжа национальностей (Qnyz202112, QNYZ202205) и Фондом науки и технологий Комиссии по здравоохранению провинции Гуйчжоу (qwjh [2022] No 101, проект gzwkj2023-251).