Интраспинальная полостная инъекция мезенхимальных стволовых клеток человека и отслеживание их миграции в мозг крысы

Для доставки мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в мозг можно использовать несколько путей введения. В настоящем исследовании МСК доставлялись по всей нейрораксии и головному мозгу путем инъекции в спинномозговую полость. МСК вводили в спинномозговые полости крыс, а миграцию стволовых клеток отслеживали и количественно оценивали.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были изучены для лечения различных заболеваний. При нейродегенеративных заболеваниях, связанных с дефектами как головного, так и спинного мозга, путь введения очень важен, потому что МСК должны мигрировать как в головной, так и в спинной мозг. В данной статье описывается метод введения МСК в спинномозговой канал (инъекция в спинномозговую полость), который может быть нацелен на головной и спинной мозг на модели крысы. Один миллион МСК был введен в спинномозговые каналы крыс на уровне поясничных позвонков 2-3. После введения крыс усыпляли через 0, 6 и 12 ч после инъекции. Для отслеживания введенных МСК использовали оптическую визуализацию и количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (кПЦР). Результаты настоящего исследования показали, что МСК, вводимые через спинномозговую полость, могут быть впоследствии обнаружены как в головном, так и в спинном мозге через 12 часов. Инъекция в спинномозговую полость имеет преимущество в том, что не требует общей анестезии и имеет мало побочных эффектов. Тем не менее, необходимо преодолеть недостаток, заключающийся в низкой скорости миграции МСК в мозг.

Мезенхимальные стволовые клетки
В условиях заболевания МСК выделяют специфические для болезни терапевтические вещества посредством паракринных действий¹, которые, как сообщается, регулируют иммунные реакции, восстанавливают поврежденные ткани и выводят токсичные вещества². Таким образом, терапия МСК считается более эффективной, чем терапия с одной мишенью, в лечении мультифакториальных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и саркопения 3,4,5,6. Кроме того, в отличие от фармацевтических препаратов, МСК обладают хоуминговым эффектом, перемещаясь в область поврежденной ткани путем распознавания воспалительных цитокинов или хемокинов в организме ^7,8. К сожалению, только часть клеток достигает поврежденного участка, и жизнеспособность МСК снижается во время миграции 9,10,11,12. Таким образом, для максимизации терапевтической эффективности МСК необходимо доставить жизнеспособные клетки к целевому участку. Поэтому при введении МСК важно выбрать правильный путь введения, исходя из характера целевого заболевания.

Путь впрыска
Существует множество путей введения терапевтических средств пациентам. Наиболее распространенными методами являются внутривенное введение в системный кровоток, пероральное введение, а также подкожное или внутримышечное введение. При нейродегенеративных заболеваниях основным препятствием в доставке терапевтических агентов в мозг является гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). ГЭБ защищает мозг от внешних патогенов с помощью плотных соединений между кровеносными сосудами и паренхимой мозга^13,14. Тем не менее, ГЭБ также парадоксальным образом препятствует проникновению терапевтических агентов в паренхиму мозга. Таким образом, прохождение через ГЭБ является основным препятствием в развитии методов лечения заболеваний головного мозга^15,16. Для преодоления этого недостатка проводится внутримозговая инъекция путем введения целевых веществ непосредственно в мозг посредством хирургической операции 17,18,19. Тем не менее, следует учитывать побочные эффекты хирургических вмешательств, особенно потому, что игла повреждает нейронные клетки во время процедуры.

Внутриспинномозговое введение
Интратекальное введение - введение лекарств в спинномозговой канал или субарахноидальное пространство - доставляет лекарства в мозг или невраксис через спинномозговую жидкость (ликвор) и является жизнеспособной альтернативой внутримозговой инъекции. Интратекальные инъекции можно подразделить в зависимости от места инъекции: латеральный желудочек, большая цистерна и спинномозговая полость. Все три пути позволяют лекарствам или клеткам рассеиваться по всей спинномозговой жидкости в головной и спинной мозг. Доставка лекарств в мозг может быть более эффективной в случае внутримозговых инъекций и инъекций внутрь цистерны, поскольку агент вводится близко к мозгу. Тем не менее, инъекция в спинномозговую полость имеет преимущества, заключающиеся в том, что она не требует общей анестезии или хирургического вмешательства для введения внутрижелудочкового резервуара,^{является в целом} безопасной и может быть выполнена повторно при необходимости.

Целью данного исследования было валидировать введение в спинномозговую полость в качестве средства доставки МСК как в головной, так и в спинной мозг. Во-первых, внутриспинальная полость была установлена на модели крысы. Затем МСК были помечены липофильным индикатором DiD (DiIC18(5); 1,1-диоктадецил-3,3,3,3-тетраметилиндодикарбоцианин, 4-хлорбензолсульфонат соль), чтобы оценить эффективность миграции стволовых клеток в спинной и головной мозг. Для оценки дисперсии клеток была проведена оптическая визуализация ex vivo. Этот простой протокол может быть выполнен без хирургического вмешательства и может быть использован с целью введения не только стволовых клеток, но и фармацевтических препаратов, антител, контрастных веществ и других веществ, предназначенных для доставки в спинной или головной мозг.

ПРИМЕЧАНИЕ: Данное исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию (номер одобрения: 20170125001, дата: 25 января 2017 г.) Института биомедицинских исследований Самсунг (SBRI) в Медицинском центре Самсунг. Являясь аккредитованным учреждением Международной ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных, SBRI действует в соответствии с руководящими принципами, установленными Институтом ресурсов лабораторных животных.

1. Получение МСК человеческого желеобразного происхождения

1. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток Уортона, полученных из желе человека (WJ-MSCs)
   1. Быстро разморозьте флакон с человеческими WJ-MSC на водяной бане при температуре 37 °C. Перенесите WJ-MSCs в коническую пробирку объемом 50 мл и добавьте питательную среду в объеме, по крайней мере, в 10 раз превышающем объем клеток (v/v). Пипетируйте вверх и вниз, чтобы подвесить клетки.
   2. Центрифугируйте при 300 × г в течение 5 мин. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, и повторно суспендируйте клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не выбросить гранулу клетки.
   3. Засейте WJ-МСК в колбах T175 с плотностью 5000-6000 клеток/^см2. Инкубируйте WJ-MSCs в инкубаторе с температурой ISO₂ при температуре 37 °C. Меняйте питательную среду каждые 72 ч до тех пор, пока WJ-MSC не достигнет 80-90% слияния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, требуется 3-4 дня, чтобы MSC достигли 80-90% конфлюенции.
2. Субкультивирование человеческих WJ-MSC
   1. Выбросьте питательную среду и промойте клетки 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Удалите PBS и добавьте 5 мл 0,25% трипсин-динатрия этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (см. Таблицу материалов). Инкубируйте клетки при 37 °C в инкубаторе с_CO2 в течение 3 минут, пока WJ-MSCs не отделятся от колбы для культур.
   2. Добавьте 5 мл питательной среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, чтобы нейтрализовать 0,25% трипсин-ЭДТА. Соберите клеточную смесь и перенесите ее в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте колбу для клеточных культур 10 мл питательной среды и соберите клетки в пробирку объемом 50 мл с помощью стерильной серологической пипетки.
   3. Центрифугируйте клеточную смесь при 300 × г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 10 мл питательной среды и подсчитайте количество WJ-МСК.
      ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны и не выбрасывайте гранулу ячейки.
   4. Засейте WJ-МСК с плотностью 4000-6000 клеток/^см2, в зависимости от эксперимента.
3. Мечение WJ-MSC красителем DiD и подготовка WJ-MSC для инъекции в спинномозговую полость
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура маркировки красителя DiD проводилась в соответствии с инструкциями производителя.
   1. Отсоедините WJ-MSC, когда они достигнут 80% конфлюенции, используя процедуру, описанную выше. Суспендируйте WJ-MSCs плотностью от 1 × 10⁶/мл в минимально необходимой эфирной среде (MEM), не содержащей фенола-красного, α без сыворотки.
   2. Добавить 5 мкл раствора для мечения DiD на 1 мл клеточной суспензии; Аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
   3. Инкубировать в течение 15 минут при 37 °C; центрифугировать клеточную суспензию при 300 × г в течение 5 мин.
   4. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте WJ-MSCs в МЭМ-α, не содержащем фенол-красного, с плотностью 1 × 10⁶/0,2 мл.

2. Инъекции в спинномозговую полость WJ-MSCs

1. Подготовка к инъекции в спинномозговую полость
   1. Обезболить 6-недельных крыс Sprague-Dawley 5% изофлураном; Затем поддерживайте анестезию 2% изофлураном на протяжении всей хирургической процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте условия анестезии перед началом эксперимента.
   2. Побрейте операционную область с помощью электробритвы для мелких животных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Электрическую бритву можно заменить ручной бритвой и гелем для бритья.
   3. Продезинфицируйте операционную область с помощью повидон-йода. Сделайте разрез на коже диаметром 3 см с помощью хирургического лезвия. Рассекайте оставшуюся кожу и мышечную ткань с помощью хирургического лезвия и ножниц. Выявить остистые отростки в поясничном отделе 2-3 (L2-3).
2. Инъекция меченых DiD WJ-MSC через интраспинальную полость
   1. Поместите крысу в положение лежа. Согните позвоночник крысы соответствующим образом, чтобы увеличить расстояние между соседними остистыми отростками, используя достаточное количество бумажной салфетки или других материалов, которые могут помочь в поддержании соответствующего положения.
   2. Наполните шприц объемом 1 мл 0,2 мл меченых DiD WJ-MSC. Поместите комбинацию шприца и иглы массой 23 г вертикально между остистыми отростками L2 и L3 и введите иглу до тех пор, пока она не коснется тела позвонка.
   3. Когда игла коснется тела позвонка, втяните его примерно на 0,5 см, поместив кончик иглы в спинномозговой канал. Наклоните шприц и поместите кончик иглы так, чтобы он был направлен в ростральном направлении. Вводите WJ-MSCs в полость позвоночника в течение 1 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость впрыска должна быть заранее оптимизирована.
   4. После инъекции полностью извлеките шприц из спинномозгового канала. Зашить разрез, а затем продезинфицировать место операции с помощью повидон-йода.
3. Лечение после процедуры
   1. Стабилизируйте и удерживайте крысу, чтобы предотвратить любое движение, положите ее вниз головой под углом 45° на 15 минут, пока она еще находится под анестезией. Через 15 минут прекратите анестезию и подождите, пока крыса проснется.

3. Оценка инъекции в спинномозговую полость

1. Эвтаназия крыс и изоляция головного и спинного мозга через 0, 6 и 12 ч после инъекции
   1. Обезболить подопытных животных 5% изофлураном; поддерживать анестезию 2% изофлураном во время перфузии PBS.
   2. Сделайте надрез ниже диафрагмы с помощью хирургических ножниц. Откройте разрез щипцами и разрежьте грудную клетку рострально, чтобы обнажить сердце.
   3. Сделайте небольшое отверстие в правом предсердии, а в левый желудочек вставьте иглу-бабочку. Перфузируйте 100 мл холодного PBS в левый желудочек в течение 4-5 минут, пока печень не очистится от крови.
   4. После перфузии сделайте длинный разрез на тыльной стороне от головы до хвоста с помощью хирургического лезвия по продольной плоскости. Изолируйте оставшийся мозг и весь позвоночник с помощью хирургических ножниц, щипцов и косторезовки. Удалите оставшиеся ребра, соединенные кости и мякоть.
2. Флуоресцентная оптическая визуализация Ex vivo DiD
   1. Поместите изолированные ткани в камеру оптического устройства визуализации.
   2. Установите следующие параметры: излучение, 700 нм; возбуждение, 605 нм; и время экспозиции, 2 секунды, в пересчете на фотоны в секунду на квадратный сантиметр на стерадиан (p/s/cm²/sr). Захват оптических изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все изображения должны быть получены с идентичными настройками освещенности (напряжение лампы, фильтры, f/stop, поле зрения и биннинг).
   3. С помощью инструмента рисования нарисуйте три прямоугольные области интереса (ROI) эквивалентного размера для спинного мозга и одну круглую область интереса для головного мозга. Измерьте интенсивность флуоресценции ROI.
3. Экстракция геномной ДНК (гДНК) из спинного и головного мозга
   1. Осторожно удалите череп и позвоночник с помощью хирургических щипцов, ножниц и ронжера.
   2. Соберите головной и спинной мозг из черепа и позвоночника. Разрежьте спинной мозг на три части (шейную, грудную и поясничную).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные ткани должны храниться при температуре -80 °C, если они не были немедленно проанализированы.
   3. Измельчите салфетки с помощью предварительно охлажденной ступки, пестика и жидкого азота. Экстрагируйте гДНК с помощью коммерческих продуктов, следуя инструкциям производителя.
4. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (кПЦР)
   1. Количественно оцените количество гДНК в каждом образце с помощью спектрофотометра.
   2. Проведите кПЦР с использованием 10 нг гДНК на образец и праймеров Arthrobacter luteus (ALU) человека^12,21.
   3. Рассчитайте точное количество WJ-MSC в образцах с помощью метода ΔΔC_T ²².

Для оценки эффективности интраспинальной полости введения МСК в настоящей работе использовались МСК, меченные DiD. Перед введением МСК в спинномозговую полость эффективность мечения оценивали in vitro с помощью оптической визуализации и флуоресцентной микроскопии (

Оптимальный путь введения для лечения МСК следует выбирать в зависимости от целевого заболевания, состояния пациента и типа доставляемого препарата. При клеточной терапии, включая терапию МСК, необходимо рассмотреть возможность прямого введения стволовых клеток в ?...

Авторам нечего раскрывать.

Это исследование было поддержано грантами Программы фундаментальных исследований Национального исследовательского фонда Южной Кореи (NRF), финансируемой Министерством образования (NRF-2017R1D1A1B03035940), и грантом Корейского проекта исследований и разработок в области технологий здравоохранения через Корейский институт развития индустрии здравоохранения (KHIDI), финансируемого Министерством здравоохранения и социального обеспечения Республики Корея (номера грантов: HI14C3484 и HI18C0560). Мы хотели бы поблагодарить Editage (www.editage.co.kr) за редактирование на английском языке.