Os dispositivos médicos de barreira sanguínea essenciais para cuidados intensivos geralmente enfrentam a formação de trombos, comprometendo a função e aumentando os riscos de trombose sistêmica. Os anticoagulantes clínicos atenuam a trombose, mas aumentam os riscos de sangramento. A absorção de proteínas nas superfícies dos biomateriais desencadeia coagulação e inflamação.
Investigamos o impacto da lavagem do polímero zoura através do revestimento na absorção de proteínas do circuito ECMO. Atualmente, não existe um anticoagulante comercial que iniba seletiva e efetivamente a trombose em dispositivos médicos sem afetar o paciente. Além disso, é essencial otimizar e demonstrar a eficácia dos revestimentos de superfície e engenharia ao longo de durações, variando de dias a semanas e até meses para vários dispositivos médicos.
Nossos novos objetivos científicos incluem avaliar a influência de diferentes abordagens de pré-processamento na aplicação de revestimentos, avaliar o impacto dos métodos de manuseio da solução de lavagem por revestimento na uniformidade do revestimento, investigar os efeitos de enxertos alternativos de polímeros anti-incrustantes na incrustação de proteínas inespecíficas e determinar a capacidade de revestimentos otimizados para limitar a trombose in vivo. Para limpar o circuito pulmonar, recircule 30% de metanol em água deionizada por 20 minutos. Em seguida, recircule 10% de metanol em água deionizada e, em seguida, apenas água deionizada por mais 20 minutos.
Seque o circuito pulmonar com ar doméstico filtrado em fluxo baixo por duas horas. Coloque o circuito pulmonar limpo e seco no gerador de plasma de ozonólise ultravioleta. Feche o gerador e ligue o instrumento para iniciar a exposição ao plasma por 20 minutos.
Depois de completar a exposição ao plasma, prossiga diretamente para a etapa de revestimento para evitar o rearranjo da cadeia superficial e a perda de locais reativos gerados pela interação do plasma. Enquanto o dispositivo sofre modificação na superfície, dissolva 1,2 gramas de cloridrato de dopamina em 600 mililitros de tampão tris em um copo de vidro. Em seguida, dissolver o monómero de metacrilato de sulfobetaine na proporção de um para 15 cloridrato de dopamina para metacrilato de sulfobetaine.
Em seguida, adicione cinco milimolares de periodato de sódio como gotículas na solução de revestimento. Use uma barra de agitação magnética e uma placa de agitação ajustada para 150 RPM para misturar bem a solução. Em seguida, prepare o dispositivo pulmonar com a solução de revestimento usando uma seringa grande para aspirar e preencher o circuito.
Prenda uma extremidade do circuito e prepare-a da outra extremidade enquanto guia as bolhas de ar para fora através de um conector de acesso ao circuito. Quando o circuito estiver totalmente preparado, coloque o dispositivo sob uma fonte de luz ultravioleta por duas horas. Agite a solução reorientando as extremidades do dispositivo principal para cima e para baixo a cada 10 minutos.
Após o tratamento de luz, drene o circuito completamente. Enxágue suavemente todas as amostras com água deionizada, aplicando primer e drenando repetidamente usando uma seringa de 60 centímetros cúbicos até que o efluente de enxágue esteja limpo. Por fim, armazene o dispositivo cheio de água deionizada em uma geladeira ajustada a quatro graus Celsius para autópsia e análises de superfície.
Para realizar o teste de absorção de fibrinogênio, transfira amostras de fibra em um mililitro de três miligramas por mililitro de solução de fibrinogênio em placas de poço e incube a placa a 37 graus Celsius por 90 minutos a 60 RPM. Lave as amostras com PBS. Transfira-os para novos poços e adicione um mililitro de um miligrama por mililitro de solução BSA a cada poço.
Incube por mais 90 minutos. Em seguida, lave as amostras mais três vezes com solução de PBS e transfira-as para novos poços. Em seguida, adicione um mililitro de uma diluição de um a 1000 de anticorpo de fibrinogênio conjugado com peroxidase de rabanete em solução de PBS para cada poço.
Depois de incubar as amostras por 30 minutos e lavá-las, transfira-as para novos poços. Nos novos poços, adicionar 500 microlitros de ofenilenodiamina em tampão fosfato de citrato com peróxido de hidrogênio a 0,03%, ajustado a um pH de 5,0 em intervalos de 30 segundos. Incubar as amostras longe da luz durante 30 minutos.
Para interromper a reação de peroxidase e ofenilenodiamina, adicione 500 microlitros de um ácido clorídrico normal a cada poço. Transfira o sobrenadante de cada poço para uma cubeta. Medir a absorvância do sobrenadante a 492 nanómetros utilizando um espectrofotómetro UV visível.
Descongele o kit de ensaio de lactato desidrogenase por 20 minutos. Enquanto o kit de ensaio está descongelando, prepare o plasma humano adulto combinado para obter plasma rico em plaquetas. Para preparar o plasma rico em plaquetas, a centrífuga descongelou tubos de amostra de plasma humano a 483 G para separar o plasma em duas regiões.
Identifique o terço inferior contendo plasma rico em plaquetas e os dois terços superiores contendo plasma pobre em plaquetas. Remova cuidadosamente os grânulos de plaquetas na parte inferior dos tubos e os dois terços superiores contendo plasma pobre em plaquetas. Disperse suavemente o pellet de plaquetas no plasma superior, agitando os tubos.
Antes do teste, adicione cloreto de cálcio ao plasma rico em plaquetas para reverter os efeitos dos citratos. Em seguida, incube as amostras de fibra em 500 microlitros de plasma rico em plaquetas por 90 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, transferir as amostras para novos alvéolos e enxaguar três vezes com a solução de PBS.
Novamente, transfira as amostras para novos poços. Adicione 300 microlitros de solução PBS e 10 microlitros de tampão de lise 10 X a cada poço. Incube as amostras por 45 minutos, depois adicione 50 microlitros da mistura de reação a cada poço e incube por 30 minutos longe da luz.
Adicione 50 microlitros de ácido clorídrico a cada poço para interromper as reações. Para detectar a atividade da lactato desidrogenase de lisados de plaquetas absorvidas, meça a absorbância de luz das soluções de poços desenvolvidas em 490 nanômetros e 680 nanômetros. A incrustação de fibrinogênio foi significativamente reduzida em fibras PP-PDMS codificadas em comparação com controles não revestidos.
Não houve diferença significativa na incrustação de fibrinogênio entre os feixes externo e interno nas fibras PP-PDMS sem condições de fluxo. Sob fluxo de PBS de 24 horas, a incrustação de fibrinogênio nos feixes externo e interno permaneceu baixa e não mostrou diferenças significativas. A incrustação plaquetária foi maior no feixe externo de fibras PP-PDMS do que no feixe interno, e controle não revestido.
A incrustação plaquetária foi significativamente maior no feixe externo em comparação com as fibras PP-PDMS codificadas no feixe interno sem exposição ao fluxo. Sob fluxo PBS de 24 horas, não foi observada diferença significativa na incrustação plaquetária entre os feixes externo e interno com baixos níveis de incrustação.
