O objetivo geral deste protocolo é agregar e encapsular células dentro de uma matriz semissólida. Agregados celulares embutidos podem então ser usados a jusante em cultura in vitro tridimensional, ou como veículo para experimentos de transplante in vivo. A principal vantagem deste método é que ele utiliza metodologia e equipamentos simples para alcançar a agregação celular.
Ele também pode ser aplicado a uma variedade de tipos de células e números. Essa técnica revelou um tipo de célula específico que é necessário para que o baço se regenere. Ele poderia descobrir outros reguladores da regeneração do tecido do baço, ou servir como uma plataforma para estudos mais amplos de engenharia de tecidos.
Comece pré-refrigerando uma caixa de ponta de pipeta de 200 microlitros dentro de um freezer de 20 graus Celsius negativos. Em seguida, submergir Parafilm em etanol 80% por 10 minutos, seguido de uma lavagem de 10 minutos em PBS. Para preparar a solução celular, alíquota o número de célula desejado em um tubo cônico de 14 mililitros.
Centrifugar as células a 200g e 4 graus Celsius durante 5 minutos. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente 20 microlitros de volume para trás. A pastilha celular pode então ser ressuspensa no volume sobrenadante restante.
Usando uma ponteira de pipeta pré-resfriada, aspirar 2 microlitros de Matrigel gelado. Torça e ejete suavemente para remover a ponta da pipeta. Estique uma tira pré-esterilizada de Parafilm e coloque-a sobre a extremidade da ponta da pipeta, tomando cuidado para não perfurar a película.
Continue a enrolar o Parafilm ao redor da lateral para garantir que a ponta esteja selada. Em seguida, coloque a solução celular suavemente sobre o Matrigel. Deixe a ponta da pipeta no gelo e prepare um tubo cônico de 14 mililitros com um tubo de cluster de 1,2 mililitro colocado dentro.
A ponta da pipeta pode então ser inserida dentro da configuração do tubo aninhado e centrifugada a 400g e 4 graus Celsius por 5 minutos. Incubar o tubo a 37 graus Celsius durante 15 minutos. O tubo pode ser colocado no gelo até que seja necessário.
Remova cuidadosamente o Parafilm da ponta da pipeta, insira um êmbolo de fio fino e expulse o plugue Matrigel no meio de cultura de tecidos. As células agregadas podem ser cultivadas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Faça a barba usando cortadores elétricos e esfregue a pele com etanol 80%.
Faça uma incisão de dois centímetros na pele perpendicular à coluna vertebral e exponha a parede peritoneal. Uma segunda incisão menor é então feita na parede peritoneal acima do rim. Aplique pressão e exteriorize o rim.
Certifique-se de que o rim é mantido úmido aplicando regularmente PBS estéril. Aperte a cápsula renal com um par de pinças ultrafinas e, usando um segundo par, rasgue suavemente em direções opostas. Separe cuidadosamente a membrana da cápsula do parênquima renal.
Levante a cápsula renal com um par de pinças e deslize lentamente a ponta da pipeta pela abertura. Introduza suavemente um êmbolo de arame na ponta da pipeta e expulse o plugue Matrigel. Umedeça o rim com PBS e reinternalize na cavidade peritoneal.
Fechar a parede peritoneal com pontos de 5-O-Vicryl e fechar a incisão da pele com um aplicador AutoClip e dois clipes de 9 milímetros para feridas. Uma etapa fundamental neste protocolo é agregar células dentro de uma matriz semissólida. O posicionamento da camada intermediária é obtido através de velocidades ideais de centrifugação.
Velocidades mais altas impulsionam as células até a ponta da pipeta, enquanto velocidades insuficientes impedem o movimento das células através da matriz. Após a solidificação, a construção Matrigel pode ser ejetada da ponta da pipeta. Construções estromais do baço que são cultivadas in vitro formam estruturas organoides esféricas tridimensionais.
Os organoides exibem uma estrutura não oca com células presentes em todo o diâmetro do tecido. Eles são compostos por três populações de células amplas, incluindo glóbulos brancos, hemácias e células estromais e endoteliais não hemopoiéticas. Construtos também podem ser transplantados sob a cápsula renal para estudos de regeneração tecidual.
Após quatro semanas, pode-se observar estrutura organizada do tecido esplênico, incluindo arteríolas centrais, folículos de células B, células reticulares fibroblásticas, células mieloides da polpa vermelha, macrófagos metalofílicos da zona marginal, sinusóides da polpa vermelha e redes de células dendríticas foliculares, zona de células T, macrófagos da polpa vermelha e células reticulares da zona marginal. Ao tentar a agregação e encapsulamento celular, é importante lembrar de trabalhar rapidamente e manter todos os materiais no gelo. O passo mais importante para os transplantes é expulsar o plugue de Matrigel enquanto retira a ponta da pipeta do rim.
Deve-se tomar cuidado para não perfurar a membrana da cápsula ou romper o parênquima renal. Este protocolo foi utilizado para investigar os requisitos para duas populações de células estromais na regeneração do tecido esplênico. Neste experimento representativo, apenas agregados esgotados de células MAdCAM negativas positivas para receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas falharam em iniciar o crescimento tecidual, sugerindo que essa população celular em particular é essencial para a regeneração do baço.
