이 프로토콜의 전반적인 목표는 반고체 매트릭스 내에서 세포를 응집하고 감싸는 것입니다. 그런 다음 임베디드 세포 응집체를 3차원 in vitro 배양에서 다운스트림으로 사용하거나 in vivo 이식 실험을 위한 수단으로 사용할 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 간단한 방법론과 장비를 사용하여 세포 응집을 달성한다는 것입니다.
또한 다양한 셀 유형 및 수에 적용할 수 있습니다. 이 기술은 비장이 재생되는 데 필요한 특정 세포 유형을 밝혀냈습니다. 비장 조직 재생의 추가 조절자를 밝혀내거나 더 광범위한 조직 공학 연구를 위한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다.
섭씨 영하 20도의 냉동고에서 200마이크로리터 피펫 팁 상자를 미리 식히는 것으로 시작합니다. 그런 다음 Parafilm을 80% 에탄올에 10분 동안 담근 다음 PBS에서 10분 동안 세척합니다. 세포 용액을 준비하려면 원하는 세포 번호를 14밀리리터 원뿔형 튜브에 분주합니다.
세포를 200g, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 조심스럽게 흡인하여 약 20마이크로리터의 부피를 남깁니다. 이어서, 세포 펠릿은 잔류 상층액 부피에 재현탁될 수 있다.
미리 식힌 피펫 팁을 사용하여 얼음처럼 차가운 Matrigel 2마이크로리터를 흡입합니다. 부드럽게 비틀어 빼내어 피펫 팁을 제거합니다. 사전 멸균된 Parafilm 스트립을 늘려 필름을 뚫지 않도록 주의하면서 피펫 팁 끝에 놓습니다.
팁이 밀봉되었는지 확인하기 위해 파라필름을 측면에 계속 감습니다. 그런 다음 세포 용액을 Matrigel 위에 부드럽게 겹쳐 놓습니다. 피펫 팁을 얼음 위에 두고 내부에 1.2mm 클러스터 튜브가 있는 14mm 원뿔형 튜브를 준비합니다.
그런 다음 피펫 팁을 중첩 튜브 구성 내부에 삽입하고 섭씨 400g 및 4도에서 5분 동안 원심분리할 수 있습니다. 튜브를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 튜브는 추가로 필요할 때까지 얼음 위에 놓을 수 있습니다.
피펫 팁에서 Parafilm을 조심스럽게 제거한 다음 얇은 와이어 플런저를 삽입하고 Matrigel 플러그를 조직 배양 배지로 배출합니다. 응집된 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양할 수 있습니다. 전기 가위를 사용하여 털을 면도하고 80% 에탄올로 피부를 면봉으로 닦습니다.
척추에 수직으로 피부를 2cm 절개하고 복막 벽을 노출시킵니다. 그런 다음 신장 위의 복막 벽에 두 번째 작은 절개가 이루어집니다. 압력을 가하고 신장을 외부로 피웁니다.
멸균 PBS를 정기적으로 적용하여 신장을 촉촉하게 유지하십시오. 한 쌍의 초미세 집게로 신장 캡슐을 꼬집고 두 번째 쌍을 사용하여 반대 방향으로 부드럽게 찢습니다. 신장 실질에서 캡슐 막을 조심스럽게 분리합니다.
한 쌍의 겸자로 신장 캡슐을 들어 올리고 구멍을 통해 피펫 팁을 천천히 밀어 넣습니다. 와이어 플런저를 피펫 팁에 부드럽게 삽입하고 Matrigel 플러그를 빼냅니다. PBS로 신장을 적시고 복막강으로 재내재화합니다.
5-O-Vicryl 봉합사로 복막 벽을 봉합하고 AutoClip 애플리어와 두 개의 9mm 감김 클립을 사용하여 피부 절개 부위를 봉합합니다. 이 프로토콜의 핵심 단계는 반고체 매트릭스 내에서 세포를 응집하는 것입니다. 중간 레이어 포지셔닝은 최적의 원심분리 속도를 통해 달성됩니다.
속도가 높으면 세포가 피펫의 맨 끝까지 추진되는 반면, 속도가 충분하지 않으면 매트릭스를 통한 세포 이동이 금지됩니다. 응고 후 Matrigel 구조체를 피펫 팁에서 배출할 수 있습니다. 시험관내에서 배양되는 비장 기질 구조는 3차원 구형 오가노이드 구조를 형성합니다.
오가노이드는 조직의 전체 직경에 걸쳐 존재하는 세포가 있는 비중공 구조를 나타냅니다. 이들은 백혈구, 적혈구, 비혈구(non-hemopoietic stromal) 및 내피세포(endothelial cell)를 포함한 세 가지 광범위한 세포 집단으로 구성되어 있습니다. 조직 재생 연구를 위해 신장 캡슐 아래에 구조물을 이식할 수도 있습니다.
4주 후, 중심 세동맥, B 세포 난포, 섬유아세포 망상 세포, 적색 펄프 골수성 세포, 변연부 금속성 대식세포, 적색 펄프 정현파 및 여포성 수지상세포 네트워크, T 세포 영역, 적색 펄프 대식세포 및 변연부 망상 세포를 포함한 조직화된 비장 조직 구조를 관찰할 수 있습니다. 세포 응집 및 캡슐화를 시도하는 동안 신속하게 작업하고 모든 물질을 얼음 위에 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이식을 위한 가장 중요한 단계는 신장에서 피펫 팁을 빼내면서 Matrigel 플러그를 빼내는 것입니다.
낭막에 구멍이 뚫리거나 신장 실질이 파열되지 않도록 주의해야 합니다. 이 프로토콜은 비장 조직 재생에서 두 개의 기질 세포 집단에 대한 요구 사항을 조사하는 데 사용되었습니다. 이 대표적인 실험에서는 혈소판 유래 성장 인자 수용체-베타 양성 MAdCAM 음성 세포가 고갈된 응집체만 조직 성장을 시작하지 못했으며, 이는 이 특정 세포 집단이 비장의 재생에 필수적임을 시사합니다.
