As florestas de algas marinhas estão enfrentando perdas sem precedentes devido a estressores ambientais impulsionados pelo clima e mudanças na dinâmica trófica. Este vídeo ilustra um protocolo e ferramentas para o cultivo de algas gigantes, Macrocystis pyrifera, usando a técnica de cascalho verde, e fornece um recurso valioso para ensaios posteriores para abordar os sucessos e limitações deste método em diferentes cenários. As instalações de cultivo de algas devem ser capazes de controlar temperaturas que variam entre 10 e 15 graus Celsius, fornecer luz de espectro completo variando entre zero e 180 fótons micromoles por metro de segundo quadrado e aeração filtrada.
Os sistemas de incubadora com uma tomada embutida ou uma porta de acesso para fios e tubulações podem ser adaptados com luzes e uma fonte de ar. Se um sistema de incubadora não estiver dentro do escopo, orçamento ou escala pretendida do projeto, banhos de água temperados por água do mar natural fria ou um chiller podem ser usados. As temperaturas de criação são específicas do local e da estação.
Coloque um termômetro em meio de crescimento ou use uma pistola de temperatura para garantir que a temperatura esteja entre 10 e 18 graus Celsius. Defina as luzes de espectro total para uma luz de 12 horas, período de foto escuro de 12 horas usando as configurações de tempo na fonte de luz ou conectando a fonte de luz a um temporizador com um ciclo programável. Meça a intensidade da luz com um medidor quântico PAR abaixo da superfície perto da brita e ajuste usando uma fonte de luz regulável, ou sobrepondo a malha sobre a fonte de luz.
A aeração é adicionada às culturas com o uso de bombas de ar. Utilize filtros com tamanho de poro de 02 micrômetros para reduzir a contaminação bacteriana transportada pelo ar. Materiais e estações devem ser esterilizados e preparados com antecedência.
Consulte o texto para obter detalhes. A brita usada para semeadura deve ter uma superfície texturizada ou ligeiramente esburacada, uma vez que os gametófitos são mais propensos a serem retidos em substratos com alta rugosidade. Esfregue e enxágue a brita até que a água fique clara para remover qualquer poeira, ou detritos.
Mergulhe a brita em uma solução de água sanitária diluída a 10% por pelo menos 24 horas e enxágue com água do mar esterilizada por filtro. Calcule o volume de água do mar esterilizada por filtro necessário para atualizar os recipientes de cultura a cada semana e programe essa tarefa de filtragem e esterilização de acordo. Grandes lotes de água do mar esterilizada por filtro podem ser armazenados em recipientes escuros por até seis meses a oito a 10 graus Celsius.
Se a refrigeração não estiver disponível, guarde em uma área escura e fria. Filtre a água usando um sistema de filtragem a vácuo com um tamanho de poro de 55 a um micrômetro. Desligue a fonte de vácuo antes que toda a água seja puxada para evitar danificar o filtro e despeje a água filtrada em um recipiente estéril dedicado.
Para volumes maiores, um sistema de filtragem de fluxo pode ser usado. Por exemplo, passe a água do mar através de uma série de três filtros plissados, 10 micrômetros, cinco micrômetros e um micrômetro, dispostos do maior para o menor tamanho de poros. Este sistema de fluxo é conectado a uma luz UV de aquário.
Esterilizar água do mar filtrada usando métodos UV e/ou autoclavagem. O enriquecimento da água do mar esterilizada por filtro com nutrientes e vitaminas é fundamental para o crescimento de algas. As opções comuns de enriquecimento incluem meios de água do mar enriquecidos com Provasoli e meios F/2.
Consulte o texto para obter detalhes. Obter as autorizações necessárias para a coleta de tecidos de algas que atendam às leis e regulamentos locais. Por meio do mergulho, selecionar de três a cinco lâminas de esporofilos de 10 a 15 indivíduos férteis de Macrocystis pyrifera com soros visíveis espaçados de dois a cinco metros entre si.
Selecione esporofilos limpos e intactos, se possível, com pouca ou nenhuma incrustação ou degradação. Armazenar lâminas de esporofilo separadamente de acordo com o indivíduo pai a partir deste ponto. Os esporófilos crescem em uma saia densa na base acima do porão da alga adulta, e podem ser identificados por sua falta de pneumatocistos cheios de gás.
Transporte as lâminas de esporofila em sacos coletores escuros para evitar a exposição excessiva à luz solar preenchidos minimamente com água do mar do local para manter as lâminas molhadas e armazenadas em caixas térmicas a aproximadamente 12 graus Celsius até a chegada ao espaço de cultivo. Certifique-se de que as amostras não estão em contato direto com o gelo. Os esporofos podem ser enviados para, ou de outros locais.
Enxaguar esporofilos com água do mar esterilizada filtrada. Embrulho de lâminas coletadas de um único indivíduo de Macrocystis pyrifera em papel toalha úmido embebido em água do mar esterilizada filtrada e novamente em papel alumínio para evitar penetração de luz e dessecação adicional. Este método de armazenamento é comumente conhecido como o método burrito.
Coloque essas embalagens em um refrigerador com gelo com uma barreira protetora, como plástico bolha reciclado ou papelão. Prepare o refrigerador para o envio durante a noite e certifique-se de que alguém esteja disponível para receber a remessa e coloque os pacotes em condições refrigeradas. Opcionalmente, armazenar esporofilos por 12 a 48 horas em condições refrigeradas, o que favorece a liberação de esporos do tecido sorus.
Para armazenar, use o método burrito. Se opcionalmente armazenado, encontrar evidências de esporulação parcial nas toalhas de papel indicando a presença de tecido sórus fértil. O tecido sórus é frequentemente ligeiramente elevado e de cor mais escura do que o tecido circundante.
Selecione o tecido sórus maduro e corte em cortes quadrados de 25 centímetros usando tesouras estéreis. Selecione de uma a duas seções de sori limpas de 10 a 15 pais individuais de algas para promover a diversidade genética. Para limpar, esfregue suavemente ambos os lados do tecido sórus em uma direção apenas com uma gaze estéril umedecida com água do mar esterilizada por filtro.
Se necessário, raspe o tecido sórus suavemente com uma lâmina de barbear estéril. Submergir a seção de soros em um banho de água doce por 30 segundos a um minuto e enxaguar com água do mar esterilizada por filtro. Submerja cada seção de sori em água do mar esterilizada por filtro temperada a 10 a 15 graus Celsius dentro de um tubo Falcon estéril de 50 mililitros.
Alternativamente, as seções de sori podem esporular em um único recipiente estéril. Coloque os tubos a quatro a 12 graus Celsius no escuro para esporular por no máximo quatro horas. Se não houver geladeira disponível, guarde em uma área fria e com pouca luz.
Usando um microscópio composto e hemocitômetro, observar a densidade de esporos de três a quatro amostras a cada 30 minutos até quatro horas. Altere as pontas da pipeta entre as amostras. Se as densidades forem de pelo menos 10.000 esporos por mililitro, passe para a próxima etapa.
Se uma secção de soros não produzir esporos após quatro horas, elimine a amostra. Os esporos podem se instalar dentro de horas após a liberação, mas podem ser observados nadando em um movimento circular. Remova cada uma das seções sori de seus tubos Falcon.
Combine as soluções de esporos resultantes em um único recipiente esterilizado e quantifique a densidade final combinada. Calcular o volume final de solução de esporos necessário para a inoculação para uma concentração final de 500 a 1.000 esporos por mililitro em recipientes de cultura. Consulte o texto para obter detalhes.
Coloque lâminas de vidro estéreis dentro de recipientes de cultura para monitorar o desenvolvimento de algas. Inclua pelo menos 30 lâminas distribuídas aleatoriamente em recipientes de cultura para monitoramento suficiente. Inocular o volume calculado de solução de esporos no recipiente de cultura usando uma ponta de pipeta estéril que contém substratos submersos em meios de crescimento.
Feche o recipiente e mexa suavemente para distribuir os esporos. Coloque o recipiente em seu sistema de cultura. Defina sua temperatura entre 10 e 15 graus Celsius com base na temperatura em seu local de implantação.
As luzes de espectro completo para plantas aquáticas são ajustadas para um ciclo de luz de 12 horas, 12 horas de escuro com intensidades de luz que variam entre zero a 180 fótons micromoles por metro de segundo quadrado. Consulte o texto para obter uma linha do tempo de condições de luz específicas. Após um dia, forneça aeração leve com uma fonte de ar filtrada.
Monitore pelo menos duas lâminas de vidro aleatórias diariamente, ou a cada dois dias nas duas primeiras semanas para avaliar o desenvolvimento. Após duas semanas, monitorar pelo menos duas lâminas de vidro aleatórias uma a duas vezes por semana quanto ao crescimento saudável e contaminação até que os esporófitos atinjam um a dois centímetros de tamanho. Para monitorar, manuseie a lâmina com uma pinça esterilizada e coloque em uma placa de Petri limpa contendo água do mar esterilizada suficiente para submergir a lâmina de vidro.
Não devolva as lâminas de vidro às culturas após a remoção para evitar contaminação cruzada. Use um composto, ou microscópio invertido em uma ampliação de 40 a 400x para observar algas em estágio inicial. Espera-se que o desenvolvimento acompanhe a seguinte linha do tempo.
Esporos sedimentados são observados de zero a um dia. Os esporos podem germinar dentro de algumas horas demonstrada pela formação de um tubo germinativo. A germinação é tipicamente observada em um a dois dias.
Os gametófitos iniciais são tipicamente observados em um a quatro dias. A gametogênese, processo pelo qual as células sofrem divisão e diferenciação para formar gametas masculinos e femininos, é tipicamente observada nas primeiras duas semanas. As células femininas são cinco a sete vezes maiores que as masculinas.
Os gametófitos masculinos crescem ramos filamentosos finos, enquanto as fêmeas são mais redondas ou ovais. As fêmeas normalmente produzem ovos dentro de duas a três semanas. Os espermatozoides liberados dos machos fertilizam os óvulos, que se desenvolvem em esporófitos embrionários.
As esporófitas são tipicamente observadas dentro de duas a quatro semanas. O zigoto sofre rápida divisão celular, resultando no crescimento de lâminas de um a dois centímetros dentro de aproximadamente seis a oito semanas. Toda semana, mude os meios de crescimento para repor os nutrientes e minerais necessários para o crescimento de Macrocystis pyrifera.
Resfriar os meios de crescimento frescos até a temperatura adequada. Certifique-se de que os meios de crescimento não excedam 15 graus Celsius durante este processo. Sifão de meios para fora de seus recipientes de cultivo para evitar a perturbação de substratos semeados.
Deixe a mídia escorrer até que o recipiente esteja quase vazio. Atualize a mídia imediatamente para minimizar a dessecação. Incline ligeiramente os recipientes de crescimento ao reencher, de modo que o meio percorra a lateral do recipiente de cultura para perturbar minimamente os substratos.
Reorganize aleatoriamente as posições do recipiente ou da cuba durante as mudanças semanais de mídia para levar em conta as diferenças na irradiância da luz. Veja o texto para um calendário para acompanhar as atividades e expectativas para as culturas de Macrocystis. Ele indica o tempo de ajustes de luz e aeração, bem como mudanças semanais de mídia.
Após seis a oito semanas de cultivo em laboratório, os esporófitos juvenis estão com um a dois centímetros de comprimento e prontos para implantação. Atualize a mídia de crescimento em contêineres de cultura 24 horas antes da implantação. Obter as licenças necessárias para implantação de cascalho que atendam às leis e regulamentos locais.
Transporte cascalho verde por até seis horas em um refrigerador sombreado. A implantação deve ser cronometrada para evitar a luz solar mais direta. Utilize uma estrutura sombreada no barco para evitar o sol direto durante o processo de implantação.
Espalhe cuidadosamente o cascalho verde da superfície para o recife abaixo, ou através de mergulho ao testar em novos locais e em pequenas escalas. A técnica de restauração de cascalho verde ainda está em fase acadêmica com dados limitados de sobrevivência de plantas externas para outras espécies e ainda sem dados para Macrocystis pyrifera. No entanto, o sucesso no campo foi observado em um estudo piloto recente, indicado pela fixação de hapteros ao substrato circundante e algas juvenis crescendo até 1,2 metros após dois meses no campo.
Usando a coleta de campo e manutenção laboratorial descritas neste protocolo, cultivamos duas populações distintas de algas doadoras a 12 graus Celsius e 20 graus Celsius para elucidar efeitos dependentes da temperatura no desenvolvimento de microestágios de Macrocystis pyrifera ao longo do tempo. Após 24 dias, gametófitos foram contados a partir de imagens de microscópio. A temperatura teve efeito para a população K1 mais fria, mas não para a população K4, sugerindo uma possível divergência adaptativa nas características de tolerância térmica.
Isso destaca a importância das temperaturas de criação específicas do local. Após 32 dias, esporófitos visíveis foram contados em cada lâmina de vidro. A temperatura teve efeito semelhante para as populações K1 e K4.
As amostras criadas a 20 graus Celsius cresceram poucos esporófitos visíveis em comparação com aquelas criadas a 12 graus Celsius. Este resultado sugere que a produção de esporófitos é mais sensível à temperatura do que a fase gametófita, e que as temperaturas de cultivo não devem exceder 15 graus Celsius para atingir o desenvolvimento dos esporófitos, conforme descrito no protocolo. Com este protocolo visualizado, esperamos encorajar mais testes com o método de cascalho verde para melhorar a restauração de valiosas florestas subaquáticas de algas marinhas por pesquisadores e gestores em todo o mundo.
Boa sorte em sua jornada de cascalho verde com Macrocystis pyrifera.
