Geração de Linhagens Celulares Knockout da Proteína Associada ao Centrômero-E ^CENP-E-/- utilizando o Sistema CRISPR/Cas9

A deleção genética de Kinesin-7 e CENP geralmente resulta em parada do ciclo celular e morte celular. A construção de linhagens celulares nocaute estáveis do CENP é uma importante questão não resolvida na biologia do CENP. Neste estudo, geramos células HeLa nocaute do CENP usando um sistema CRISPR/Cas9 e estabelecemos três estratégias de triagem otimizadas.

Recentemente, várias tecnologias de edição do genoma, incluindo nucleases de dedo de zinco, nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição e como fazemos nossas nucleases, foram projetadas para clivar genomas em um tamanho específico. A tecnologia de nocaute genético CRISPR/Cas9 revolucionou a biologia básica, a biotecnologia e a medicina. O CENP é essencial para fixar cinetócoros a microtúbulos e alinhar cromossomos.

A interrupção do CENP, seja por microinjeção de anticorpos, deleção de sgRNA, inibição química ou deleção genética, resulta em desalinhamento cromossômico, defeitos mitóticos e, muitas vezes, morte celular, complicando o estudo dos mecanismos da proteína CENP. Neste estudo, três estratégias otimizadas de triagem baseadas em fenótipos foram estabelecidas, incluindo triagem de colônias celulares, alinhamento cromossômico dos fenótipos e intensidades fluorescentes das proteínas CENP, o que melhorou a eficiência da triagem e a taxa de sucesso experimental. É importante ressaltar que a deleção do CENP resulta em desalinhamento cromossômico, localização anormal das proteínas BubR1 e defeitos mitóticos.

Os modos de interação e os mecanismos moleculares do CENP e seus inibidores são importantes campos de pesquisa em biologia celular e pesquisa em câncer. Neste estudo, a linhagem celular HeLa knockout do CENP foi estabelecida como uma ferramenta valiosa para a validação da especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP.