Este protocolo apresenta um método multinível, tanto para a detecção do EST quanto para a figura do fago. Ele também introduziu um grande índice para salvamentos para comparar os níveis de EMR de diferentes tecnologias de controle. Esta técnica econômica é inteligente, de alto rendimento e multifuncional.
Isso permitiu o estabelecimento do VAMS, uma rede de monitoramento veterinário que coletou 20.000 genes epidêmicos e fagos analíticos. Este método também pode ser usado para monitorar e controlar bactérias patogênicas na medicina, agricultura, bateria de coração animal, e a pesca. Este protocolo e este documento da empresa devem fornecer para ser um.
Nós com guia de treinamento técnico. Segui-lo ajudaria qualquer um a dominar a técnica em um curto espaço de tempo. Comece incubando o organismo de controle de qualidade E.coli e 93 cepas de salmonela de teste em placas de ágar Mueller-Hinton.
Em seguida, diluir o inóculo preparado de cada cepa 10 vezes. Transferir 200 microlitros de soro fisiológico normal estéril para o poço a-1 de uma placa de 96 poços como controle negativo. Em seguida, pipetar duas suspensões de E.coli nos poços a-2 e a-3 como controles positivos e de qualidade, respectivamente.
Aos 93 poços restantes, adicionar 200 microlitros da cepa de teste diluída. Para a preparação das placas de ágar antimicrobianas. Primeiro, defina as faixas de concentração para os diferentes agentes antibacterianos que estão sendo testados, de acordo com o índice LAR.
Executar um esquema de diluição log-two de duplicação para a solução antibiótica seguindo o método de diluição em ágar padrão CLSI. Agora adicione dois mililitros da solução antimicrobiana a um frasco de vidro esterilizado contendo 18 mililitros de meio de ágar Mueller-Hinton fundido. Depois de misturar completamente, despeje em placas dentro de um armário de biossegurança.
Deixe o ágar solidificar à temperatura ambiente. Certifique-se de deixar uma lacuna sob a tampa das placas para permitir a secagem da superfície do ágar. Rotular os tipos de agentes antimicrobianos e suas respectivas concentrações na parte inferior das placas incubadas.
Organize as múltiplas placas incubadas para cada agente antimicrobiano em uma pilha disposta em log dois duplicando a ordem de diluição. Finalmente, prepare duas placas de ágar sem drogas para atuar como controles para cada agente. Instale uma placa de pino de inoculação esterilizada no suporte de um inoculador matricial de 96 pontos dentro de um gabinete de biossegurança.
Em seguida, disponha o bloco de sementes preparado com cepas testadas e uma placa incubada de ágar na transportadora móvel. Empurre o carregador móvel até que o bloco de sementes esteja abaixo da placa do pino de inoculação. Agora pressione a alça de operação e abaixe a placa do pino de inoculação, guiando os 96 pinos em direção ao inóculo nos 96 poços do bloco de sementes.
Solte a alça de operação de forma controlada e redefina automaticamente a placa do pino de inoculação para agitar cada poço de inóculo e mergulhe, empurre a alça de operação de duas a três vezes. Depois, desloque e posicione a placa transportadora de modo que a placa de incubação fique sob a placa do pino de inoculação. Pressione a alça de operação, abaixando a placa do pino de inoculação e deixando-a por um a dois segundos para garantir o contato total com a superfície da placa incubada.
Solte a alça de operação para completar uma rodada de inoculação. Substitua a placa incubada e repita o processo até que o lote de placas de ágar antimicrobiano esteja concluído. Mude para uma nova placa de pino de inoculação e bloco de sementes para inocular outro grupo de cepas testadas.
Incubar as placas de ágar antimicrobiano inoculadas à temperatura ambiente até que a umidade dos pontos de inóculo seja completamente absorvida pelo ágar. Após a incubação, inverta as placas e continue a incubação para permitir que bactérias não inibidas formem colônias. Para realizar a aquisição de imagens e estatísticas de dados, comece clicando no sistema de aquisição de imagens AST de 96 pontos matriciais para iniciar o programa.
Na barra de tarefas, selecione informações de teste. Clique em novo para criar uma nova tarefa de teste e preencher os detalhes necessários. Em seguida, pressione a coleta de dados seguida de fotografia e item de teste para selecionar a tarefa recém-criada.
Escolha antibióticos para selecionar o nome do antibiótico e gradiente para selecionar a concentração inicial do antibiótico. Por fim, clique em conectar para estabelecer uma conexão com o conversor de aquisição de imagem. Em seguida, coloque as placas incubadas na base da placa de detecção e insira-as no conversor de aquisição de imagens.
Clique na coleção para capturar imagens das placas. Pressione antibióticos e selecione o próximo conjunto de placas. Escolha gradiente para identificar o gradiente inicial e, em seguida, prossiga para a próxima rodada da coleção de imagens.
Finalize o procedimento clicando em enviar para determinar a formação de colônias e converter as imagens em concentrações inibitórias mínimas, ou seja, valores de MIC. Clique na consulta para acessar todos os resultados do MIC. Comece utilizando o método de ágar de camada dupla para produzir diferentes fagos.
Diluir os fagos para uma concentração paralela adequada e adicionar 200 microlitros do inóculo do fago no bloco de sementes de 96 poços. Em seguida, prepare uma placa incubada de camada dupla para cada cepa a ser examinada. Deixe uma lacuna sob a tampa da placa de camada dupla para permitir a secagem.
Coloque o bloco de sementes de fago preparado e a placa de camada dupla no portador móvel do inoculador matricial de 96 pontos. Transfira todo o fago inocular para a superfície do semiágar. Deixe as placas permanecerem à temperatura ambiente até que toda a umidade inocular tenha sido absorvida pelo semiágar.
Agora incube as placas a 37 graus Celsius para as cepas testadas por quatro a seis horas. Use o conversor de aquisição de imagens para obter e salvar a imagem do resultado experimental de cada placa de dupla camada. Registre o número e as morfologias das diferentes formas de manchas em uma planilha com base nas imagens obtidas e calcule as respectivas proporções dos diferentes tipos de fagos.
O estudo morfológico do crescimento de salmonelas em placas com ampicilina mostrou que o controle negativo em a-1 não apresentou crescimento. A CIM da cepa de salmonela em a-4 foi de 64 microgramas por mililitro, enquanto a de a-5 foi de 16 microgramas por mililitro. Os valores percentuais de resistência de ampicilina, ciprofloxacina e amoxicilina-clavulanato foram superiores a 50%, enquanto os de doxiciclina, florfenicol, cefotaxima e enrofloxacina foram de 30% a 50%Gentamicina, amicacina e meropenem apresentaram valores percentuais de resistência inferiores a 30%Os índices de LAR de ciprofloxacina e amoxicilina-clavulanato diferiram significativamente.
Análises morfológicas do crescimento de salmonelas em placas de camada dupla mostraram que quatro pontos principais morfológicos de fagos foram observados. O ponto lítico claro redondo era de um fago que poderia matar o hospedeiro de forma confiável na placa, mas que pode ou não se replicar com sucesso às custas desse hospedeiro. A coleção de placas foi formada por placas verdadeiras.
O ponto lítico turvo resultou de um fago que não matou de forma confiável o hospedeiro na placa, e que pode ou não se replicar com sucesso às custas desse hospedeiro. A mancha não lítica indicou natureza não lítica. Esta técnica transfere facilmente uma lente de ágar 96 de uma só vez e os instrumentos reconhecem automaticamente as imagens e, em seguida, calculam os dados de linha.
Espera-se que esta tecnologia promova a pesquisa e a industrialização de fagos e a aplicação de fagos é uma das maneiras surpreendentes de reduzir e resolver o problema do AMR.
