Nossa plataforma usa tecidos musculares projetados em 3D e hardware de detecção magnética para medir a contratilidade em 24 poços simultaneamente. Isso fornece um método de maior rendimento para avaliar novas terapias in vitro usando tecidos musculares humanos. Nosso método de fundição melhora a consistência e a reprodutibilidade na fabricação de tecidos musculares projetados em 3D.
Projetamos uma placa de fundição consumível de 24 poços equipada com hardware de detecção magnética para medições e análises de contratilidade em nossa plataforma. Este método pode fornecer informações valiosas sobre a modelagem de doenças in vitro, a descoberta de medicamentos e a terapia gênica para qualquer doença muscular que afete a contratilidade. Atualmente, estamos incorporando neurônios motores em nossas construções 3D para criar um modelo de junção neuromuscular também.
Para começar, coloque um kit de fundição de tecido pré-resfriado em um bloco frio ou gelo dentro do exaustor de cultura de células. Coloque a placa de fundição plana no gelo. Adicione trombina ao meio de base para fazer a solução de trombina e mova a rede de pós-treliça da placa de fundição para uma nova placa estéril de 24 poços.
Pipetar 50 microlitros de solução de trombina em cada poço pré-refrigerado da placa de fundição e colocar a treliça de volta no kit. Coloque o kit de fundição de lado no gelo. Em seguida, adicione 500 mililitros de meio RPMI, 10 mililitros de B27 e 2,5 gramas de ácido aminocapróico, ou ACA, para preparar o meio EMT cardíaco.
Retire o meio EMT que será usado para moldar os tecidos e adicione 10 inibidores micromolares de ROCK a ele. Prepare o meio EMT esquelético adicionando 50 mililitros de meio F10 e 0,25 gramas de ácido aminocapróico, ou ACA, para mioblastos primários. Use 0,1 gramas de ACA para mioblastos derivados de IPSC.
Em seguida, filtre estéril, o meio de fundição contendo ACA. Aqueça o reagente de dissociação do grau de cultura celular e um volume igual de EMT médio a 37 graus Celsius. Este meio EMT aquecido será usado para diluir o reagente de dissociação.
Lave as células com PBS e adicione o reagente de dissociação aquecido para levantar as células. Incube a 37 graus Celsius por cinco minutos ou até que as células tenham levantado e verifique as culturas a cada dois ou três minutos, tocando no lado da placa. Uma vez que as células tenham levantado, transfira-as para um tubo cônico de 50 mililitros.
Triturar com uma pipeta P-1000 para garantir uma suspensão de célula única. Lavar a placa e o balão com um meio EMT adicional para recolher as células restantes e adicioná-las ao tubo cónico. Novamente, triture as células para garantir uma única suspensão celular.
Adicione o meio EMT para encerrar o processo de dissociação e, em seguida, tire amostras das suspensões celulares para contagens de células. Realize contagens de células usando um contador de células automatizado ou um hemocitômetro em azul de tripano. Gire as células a 200 G por quatro minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em cinco mililitros do meio de base EMT para remover o reagente de dissociação residual.
Depois de centrifugar novamente por quatro minutos, aspirar o sobrenadante e preparar as suspensões celulares nas densidades apropriadas. Calcular os volumes de cada solução celular necessária para compor o número desejado de tecidos e pipetar os volumes calculados de células para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione 10 microlitros de fibrinogênio por EMT à suspensão celular e coloque-a no gelo.
Certifique-se de que cada EMT tenha 90 microlitros de suspensão celular, 10 microlitros de fibrinogênio e 50 microlitros de solução de trombina na construção final do tecido. Em um exaustor de cultura de células, remova a tampa do kit de fundição de tecido e coloque a placa de fundição com a pós-treliça deitada no gelo. Misture a mistura de fibrinogênio celular e desenhe 100 microlitros com uma pipeta P-200.
Adicione 100 microlitros da mistura a poços preparados com 50 microlitros de solução de trombina e triturar cinco vezes para misturar bem. Não empurre a pipeta para além da primeira paragem e remova a ponta após a trituração para evitar a criação de bolhas. Misture a suspensão celular no tubo cônico antes de fundir cada tecido.
Segure a treliça e a placa do poço de fundição simultaneamente usando o dedo indicador e o polegar de uma mão para evitar qualquer movimento da rede ou deixe a placa plana no gelo e agite o balde de gelo para ver a placa de fundição. Repita com uma ponta P-200 fresca para cada tecido até que todos os tecidos estejam moldados. Transfira cuidadosamente o kit semeado para a incubadora e incube a 37 graus Celsius por 80 minutos.
Em seguida, prepare uma placa fresca de 24 poços com dois mililitros por poço do meio EMT para tecidos cardíacos e incube a placa a 37 graus Celsius para aquecer o meio. Após a incubação de 80 minutos, adicione suavemente um mililitro do meio EMT à borda dos poços de fundição e incube por mais 10 minutos a 37 graus Celsius. Após 10 minutos de incubação, levante cuidadosamente a pós-treliça e transfira os tecidos da placa de fundição para uma placa preparada de 24 poços com o meio aquecido.
Finalmente, devolva as placas com tecidos à incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius. A produção malsucedida de EMT pode variar de falhas catastróficas, como o descolamento de tecido dos postes, a falhas estruturais mais sutis, como bolhas de ar e deposição desigual de tecido em torno de ambos os postes. A construção EMT um dia após o casting é mostrada aqui.
Os tecidos musculares esqueléticos foram transferidos para um meio de diferenciação a partir do dia zero de fusão celular e compactação em hidrogel. Do sétimo dia até o dia 28, o mesmo EMT exibiu um comprimento total ligeiramente menor entre os dois postes e uma largura menor quando medido através da seção do meio do EMT. Quatro placas de tecidos foram rastreadas ao longo de 21 dias comparando o diâmetro da EMT ao longo da compactação.
Os pontos de tempo mostram o tamanho consistente do EMT entre as placas. A compactação máxima é alcançada no dia 21, à medida que a remodelação da matriz é estabilizada. A imuno-histoquímica dos EMTs é descrita aqui.
Os EMTs foram fixados no dia 10 de cultura e embutidos em parafina. Cortes transversais finos foram corados com anticorpos contra a cadeia pesada de miosina e distrofina antes da imagem. Essas imagens gráficas representam a força de contração absoluta média medida a partir dos EMTs cardíacos e dos EMTs esqueléticos ao longo do tempo.
O tratamento com doxorrubicina aguda e crônica em tecidos cardíacos modificados é mostrado aqui. Três concentrações de dose diferentes de Dox foram administradas em bolus ou administradas continuamente aos tecidos cardíacos modificados ao longo de 27 dias. A resposta à dose de BDM em tecidos musculares esqueléticos modificados é apresentada nesta figura.
A frequência de batimento cardíaco ou de contração cessa de forma dose-dependente em conjunto com uma cessação da força contrátil indicando cardiotoxicidade quando os EMTs são expostos a este composto. As coisas mais importantes a lembrar ao fundir tecidos são manter tudo frio em todos os momentos, incluindo sua suspensão celular e reagentes e manter a rede de pós-poste completamente estacionária assim que a fundição começar.
