O pirosequenciamento é uma técnica de sequenciamento por síntese que pode ser usada para genotipar polimorfismos de nucleotídeo único no DNA mitocondrial. Este método é vantajoso pela facilidade de implementação e custo-efetividade quando comparado a outros métodos de sequenciamento. Pode ser facilmente usado como método diagnóstico para certas doenças mitocondriais, determinando valores heteroplasmáticos de variantes patogênicas no DNA mitocondrial.
Para começar, obtenha um arquivo de sequência de DNA mitocondrial para a espécie a ser genotipada e identifique a posição do polimorfismo de nucleotídeo único, ou SNP. Assegurar que a sequência de referência utilizada empregue a numeração de base apropriada para a mutação estudada, de modo a que a posição do SNP possa ser facilmente identificada. Copie 1.000 pares de bases a montante e a jusante do site SNP e cole a sequência truncada no software de design de primer pirosequenciante.
Realce a base polimórfica, clique com o botão direito do mouse sobre ela e selecione Definir região de destino para definir a base SNP analisada como o destino do ensaio de pirosequenciamento. Pressione o ícone Play no canto superior direito da interface para iniciar a seleção do primer e aguarde até que o software gere automaticamente os trios de primer, dois primers para pré-amplificação do DNA do molde e o terceiro primer para sequenciamento pela síntese na máquina de pirosequenciamento. Clique com o botão direito do mouse e selecione Copiar todos os conjuntos de primers para manter todos os conjuntos de primers.
Abra o software de execução fornecido com o pirosequenciador, selecione Novo ensaio e, em seguida, selecione o modelo de ensaio de quantificação de alelos. Insira a sequência a ser analisada na caixa correspondente digitando os nucleotídeos diretamente a jusante do primer de sequenciamento. Para a posição variável, denote as duas bases possíveis, separadas por uma barra.
Pressione Generate Dispensation Order e deixe que o software determine automaticamente uma ordem adequada para os nucleotídeos a serem dispensados no sequenciamento por reação de síntese. Salve e forneça um nome para o ensaio. Em seguida, execute a corrida diluindo o DNA a ser analisado para 5 nanogramas por microlitro.
Na primeira execução, certifique-se de incluir amostras de heteroplasmia conhecida como referência e amostras de tipo selvagem. Em seguida, realizar um pré-sequenciamento PCR de 5 microlitros de DNA diluído e reações de 25 microlitros, utilizando os primers e parâmetros de amplificação. Para executar a configuração do arquivo, selecione Nova execução no software pirosequenciador.
O pirosequenciador pode sequenciar simultaneamente 48 reações pré-amplificadas separadas com um quadrado vazio representando um único poço de sequenciamento em um disco pirosequenciador. Carregue os ensaios clicando com o botão direito do mouse em um quadrado e selecionando Carregar ensaio. Se necessário, sequencie até quatro ensaios separados com iniciadores de sequenciamento diferentes.
Defina o modo de dispensação do primer como automático para atribuir automaticamente uma câmara de injeção para cada primer de sequenciamento usado para a execução. Defina o modo de execução como padrão, a menos que execute quatro tipos diferentes de ensaios em um disco de sequenciamento. Verifique se o número de ensaios no arquivo de modelo de execução corresponde ao número de reações de PCR que estão sendo amplificadas.
Em seguida, salve os arquivos executados em uma unidade USB. Para acionar o pirosequenciador, pressione o botão de limpeza na tela principal sensível ao toque do dispositivo e limpe todos os injetores com água de alta pureza, seguindo as instruções na tela. Ao inserir a tira do absorvedor na máquina, certifique-se de que as extremidades se encontram na posição das 9 horas.
Depois de conectar o pendrive, pressione o botão Sequence para carregar os arquivos de execução preparados anteriormente. Siga as instruções no dispositivo para carregar e colocar os reagentes, conforme necessário, nos injetores correspondentes na máquina. Coloque 3 microlitros de contas nos poços e, em seguida, carregue 10 microlitros de cada reação de PCR para ser sequenciado na amostra correspondente.
Pipetar para cima e para baixo para misturar a amostra com as esferas magnéticas. Procure a indicação no pirosequenciador preparado de que o disco pode ser carregado na máquina. Desparafuse a porca de retenção da placa e alinhe a placa de amostra carregada com o pino de metal no compartimento do disco.
Uma vez que a placa está firmemente parafusada no compartimento da placa, inicie a execução de sequenciamento pressionando o botão de início na interface da tela sensível ao toque. Quando a execução estiver concluída, remova a unidade USB da máquina e conecte-a novamente ao computador que executa o software pirosequenciador. Depois que o arquivo de execução recém-gerado aparecer na unidade USB, clique duas vezes no arquivo de resultado da execução.
Isso analisa automaticamente a saída de luciferase de cada poço após a incorporação de nucleotídeos e quantifica o alelo mitocondrial de interesse. Procure as pontuações de cores mostradas pelo software com base na qualidade das leituras. Para salvar os resultados, selecione Relatórios na janela superior, seguido de Relatório Completo para gerar um arquivo PDF contendo os pirogramas e os resultados de cada poço da execução.
Como alternativa, baixe os resultados em outros formatos na guia Relatórios. Eletroforese em gel de agarose de uma amplificação por PCR usando os primers de amplificação de ambos os conjuntos selecionados para a mutação m. 3243A>G como mostrado nesta figura.
Aqui, Het denota a amostra quase homoplasmática m. 3243A>G a ser analisada. Uma comparação do desempenho de ambos os conjuntos de primers utilizando padrões molares para calibração é mostrada nesta figura.
Os valores medidos são indicados pelas linhas pontilhadas verticais. Uma função linear X=Y é exibida para ilustrar o quão próximo cada um dos dois ensaios testados está de uma medição ideal. Os nomes das linhagens celulares no eixo X são os nomes dos vários clones de cybrid que foram genotipados usando este ensaio.
Resultados de genotipagem em quatro clones de cybrid de heteroplasmia desconhecida m. 3243A>G usando ambos os ensaios são mostrados aqui. O sequenciamento foi realizado em triplicata técnica.
Os resultados de genotipagem de células mitocondriais tratadas com nuclease de dedo de zinco, juntamente com controles não tratados e tratados simuladamente, e os pirogramas de duas réplicas de PCR de amostra de células MEF usadas para gerar os resultados, bem como o controle de genotipagem selvagem, são mostrados aqui. O pirosequenciamento pode ser usado como uma leitura para experimentos de terapia gênica para avaliar várias tecnologias de terapia gênica no DNA mitocondrial.
