Este protocolo explica como fabricar e usar tecnologias de microfluídica para aproveitar os benefícios experimentais na taxa de transferência de amostras, manuseio automatizado e a capacidade de aplicar com precisão o estresse mecânico e, ao mesmo tempo, visualizar amostras. Essa técnica minimiza o manuseio manual de organismos biológicos multicelulares, como embriões e organoides, para sua imobilização, alinhamento e imagens vivas. Também permite a aplicação de compressão mecânica a eles para estudos de mecanobiologia.
A fabricação de moldes com características de alta proporção para este chip microfluídico pode ser um desafio com técnicas convencionais de microfabricação. As dicas explicadas neste artigo em vídeo podem superar esses desafios. Para começar, limpe a bolacha de silício primeiro com acetona e, em seguida, com álcool isopropílico.
Coloque a bolacha de silício em uma placa quente de 250 graus Celsius por 30 minutos. para desidratação assar. Revestir a bolacha de silício com hexametildisiloxano em um forno de vapor prime.
Coloque uma garrafa de SU-8 2100 Photoresist em um forno de 60 graus Celsius por 15 minutos para reduzir sua viscosidade. Despeje um mililitro do Photoresist aquecido para cada polegada da bolacha de silício colocada na placa quente até que o Photoresist cubra a maior parte da superfície. Aplique o pré-spin primeiro a 250 rotações por minuto durante 30 segundos e, em seguida, a 350 rotações por minuto durante mais 30 segundos, ambos com aceleração de 100 RPM por segundo.
Em seguida, aplique um giro primeiro a 500 rotações por minuto por 15 segundos com aceleração de 100 RPM por segundo e, em seguida, a 1.450 rotações por minuto por 30 segundos com aceleração de 300 RPM por segundo. Remova o talão de borda com um cotonete limpo e pulverize acetona na bolacha para remover imperfeições e promover o revestimento uniforme. Exponha a bolacha de silicone a 350 milijoule por centímetro de luz UV quadrada através da máscara fotográfica.
Usando o alinhador de máscara de contato, aplique o cozimento pós-exposição na bolacha de silício e deixe-a esfriar até a temperatura ambiente. Coloque o copo dentro de outro copo maior e encha o copo maior com uma nova solução de revelador. Coloque uma malha de metal no béquer.
Coloque a bolacha de silício na malha de metal de cabeça para baixo. Deixe a bolacha de silício submersa na incorporadora por 30 minutos com o agitador ligado. Transfira a bolacha de silício para um sonicator de banho ultrassônico cheio do revelador fresco por uma hora a 40 kilohertz.
Em seguida, retire a bolacha do copo e lave-a com uma nova solução de revelador. Prepare a solução PDMS pré-curada misturando a base PDMS com o agente de cura na proporção de 10 para um. Desgaseifique a mistura colocando-a numa centrífuga durante 500 g durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Despeje o PDMS pré-curado em uma bolacha de silício e desgaseifique-o novamente. Finalmente, coloque o PDMS não curado em forno de 60 graus Celsius para cura. Use um bisturi para cortar as bordas da região PDMS curada correspondente à geometria do chip microfluídico.
Soque os orifícios de entrada e saída no PDMS usando um soco de biópsia ou uma agulha com uma ponta contundente. Coloque o PDMS na lâmina de vidro com sua superfície padronizada voltada para a lâmina de vidro após o tratamento a plasma para selar os microcanais através de ligação covalente. Permita que as moscas adultas do Oregon-R coloquem ovos em placas de ágar suco de maçã e colete as placas no momento de desenvolvimento desejado após a postura dos ovos para o experimento dado.
Inunde o ágar com lavagem de ovos embrionários e agite suavemente os embriões com um pincel para desalojá-los do ágar. Transfira os embriões para uma solução de alvejante a 50% durante 90 segundos, mexendo de vez em quando. Coe os embriões através de uma peneira de tecido e lave bem a solução de água sanitária com água.
Transfira os embriões para uma placa de Petri de vidro de 90 milímetros com lavagem de ovos embrionários suficiente para cobrir totalmente os embriões. Examine os embriões com transiluminação em um microscópio de dissecação e selecione embriões do estágio de desenvolvimento desejado para carregamento no dispositivo microfluídico. Prepare todos os sete microcanais embrionários preenchendo-os com 0,4 micrômetros de IPA filtrada através da porta de entrada principal do embrião.
Substitua o IPA por 0,4 micrômetros de água desionizada filtrada. Em seguida, substitua a água DI por uma solução de lavagem de ovos embrionários. Colete aproximadamente 100 embriões pré-selecionados da placa de Petri de vidro usando uma pipeta de vidro.
Em seguida, pipete os embriões para a porta de entrada do embrião e aplique aproximadamente três pressões negativas PSI na entrada de gás usando uma bomba de vácuo portátil para abrir os microcanais embrionários. Em seguida, incline o chip microfluídico para baixo para que os embriões se alinhem automaticamente e se instalem nos microcanais embrionários. Se as entradas do microcanal do embrião ficarem entupidas por vários embriões que entram simultaneamente, incline o chip microfluídico para cima e depois para baixo novamente para limpar o entupimento.
Com base no rendimento necessário, introduza até 300 embriões nos microcanais embrionários. Uma vez que o carregamento do embrião esteja concluído, remova o vácuo para imobilizar os embriões. Em seguida, incline o chip microfluídico de volta à posição horizontal.
Conecte uma fonte de pressão positiva portátil com um manômetro à entrada de gás para aplicar três compressões PSI. Se experimentos de imagem ao vivo forem conduzidos nos embriões estimulados mecanicamente, coloque o chip microfluídico em um suporte de lâmina de vidro de estágio de microscópio padrão com a entrada de gás conectada à fonte de pressão. Examine os embriões sob um microscópio fluorescente dentro dos canais microfluídicos.
Uma vez que o experimento de compressão é concluído, os embriões podem ser coletados para análise a jusante. Para fazer isso, primeiro, aplique o vácuo na entrada de gás para liberar os embriões. Em seguida, incline o chip microfluídico para cima para que os embriões se movam para baixo em direção à porta de introdução do embrião.
Recolha os embriões do chip microfluídico utilizando uma pipeta de vidro. A funcionalidade do dispositivo microfluídico foi determinada experimentalmente carregando embriões de Drosophila nos canais de compressão e aplicando pressão positiva nos canais de gás. Os embriões não experimentam compressão significativa sob vácuo ou em estados de pressão neutra.
Eles são comprimidos quando a pressão positiva é aplicada. Medições da largura decrescente dos embriões sob um microscópio demonstram como a pressão do gás pode ser usada para obter um nível de compressão alvo. Dispositivos microfluídicos feitos desta forma permitem a estimulação química de amostras imobilizadas.
A estimulação permite imagens espaço-temporais elevadas. Uma questão fundamental na biologia do desenvolvimento é como as forças mecânicas regulam a expressão de proteínas e genes durante o desenvolvimento? Essa tecnologia nos permite aplicar estimulação mecânica a um grande número de embriões de uma só vez, para que possamos isolar quantidades suficientes de proteína e RNA para realizar experimentos comparativos de proteômica ou transcriptômica.
Isso permitirá que os pesquisadores aprendam mais sobre as proteínas e genes que são sensíveis às forças mecânicas.
