Todos os organismos têm desordem em seu proteome, estimado em até 33% Essas regiões são observáveis pela espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério, mas apenas na faixa de tempo de milissegundos. Nosso protocolo mostrará como fazer isso com sucesso. Esta é uma técnica analítica totalmente automatizada.
Você apenas configura tudo, programa as medidas de tempo desejadas, bate ir e ir embora. Esta técnica abre a oportunidade emocionante de triagem de compostos que estabilizam confirmações específicas de proteínas intrinsecamente desordenadas, tais alfa-sinucleína. Para iniciar a preparação da amostra para o mapeamento do peptídeo, primeiro pegue um frasco de estoque de proteína alfa-sinucleína armazenado do congelador de menos 80 graus Celsius.
E uma vez descongelado, filtrar usando um filtro de seringa de 0,22 micrômetros. Em seguida, meça a absorvância da solução em 218 nanômetros para determinar a concentração de proteínas usando a lei de Beer-Lambert, e dilua a proteína com tampão de equilíbrio para uma concentração final de cinco micromolares. Em seguida, para configurar o robô autosampler, adicione 50 microlitres da solução de proteína de cinco micromolares a um frasco de recuperação total, e coloque o frasco na posição amostral na câmara direita da troca de hidrogênio/deutério, ou HDX, robótico em linha com o espectrômetro de massa.
Em seguida, coloque um frasco de tampão de equilíbrio e dois frascos de tampão de lavagem de pepsina para as posições de reagente um, quatro e cinco das câmaras esquerdas e um frasco de tampão de saciamento para a posição do reagente um na câmara direita HDX e definir a temperatura em 20 graus Celsius usando o controlador de temperatura Peltier. Em seguida, adicione um número igual de frascos de recuperação total e frascos máximos de recuperação nas mesmas posições de reação da câmara esquerda HDX e da câmara direita HDX, respectivamente. Em seguida, configure uma lista de amostras com métodos LC e MS apropriados no software de agendamento e inicie o cronograma.
Para obter o mapa final de cobertura de peptídeos, faça a curadoria manual das atribuições isotópicas no software de análise de dados DynamX HDX. Depois de limpar o instrumento protótipo Fast HDX, abra a interface gráfica do usuário do software HDX compatível para inicializar o sistema. Digite 20 graus Celsius e 0,5 graus Celsius como a câmara amostral e saciar as temperaturas da câmara, respectivamente, seguido de clique definido para aplicar as novas temperaturas.
Para limpar e preparar o instrumento, configure os tubos de centrífugas com água de grau LC/MS em todas as entradas, verifique as seringas esquerda e direita na guia de entrega de encanamento do titulante e continue clicando no prime até que todas as bolhas de ar latentes nos tubos se foram. Para verificar todas as caixas em busca de seringas, primeiro vá para a guia macros e clique na posição inicial das seringas calibradas, em seguida, primeiro clique em lavar o laço de carga da seringa, seguido por lavar todos os volumes de loop de mistura. Se houver alguma bolha em uma seringa tampão, desconecte a seringa e desgas-la ejetando verticalmente a bolha.
Antes de recalibrar para a posição zero, substitua a seringa. Para configurar o instrumento protótipo Fast HDX para experimentos HDX, insira primeiro o tubo de entrada de titulação esquerda no frasco de recuperação total. Para evitar a oligomerização e agregação induzidas pela temperatura, coloque o tubo em uma geladeira de mesa.
Em seguida, adicione 50 mililitros de equilíbrio, rotulagem, saciamento e tampões de lavagem de pepsina às respectivas entradas tampão nas câmaras direita e esquerda do instrumento, seguido pela adição de 50 mililitros de tampão de lavagem de coluna à entrada de lavagem de pepsina. Para escorraçar as linhas de lavagem de proteínas e colunas, verifique as seringas direita e esquerda na guia de entrega de encanamento do titulante e clique no prime uma vez. Depois de verificar todas as caixas em busca de seringas como demonstrado anteriormente, vá para a guia de fluxo de saciamento manual para inserir as configurações necessárias.
Para um experimento de curso de tempo, use o botão de ponto simbólico para inserir os tempos em milissegundos. Em seguida, configure o tempo de armadilha para três e a espera para hplc para prender tempo mais tempo de execução mais 1,5 minutos. Se os experimentos em branco forem executados entre os executes de amostra, clique na caixa em branco de execução depois de garantir uma entrada no software de aquisição para a execução em branco após cada amostra executada.
Uma vez que a lista de amostras esteja pronta e as entradas apropriadas tenham sido destacadas, inicie a execução clicando em reprodução e Fast HDX no software. Para processamento de dados, abra o menu de arquivos do arquivo de peptídeos atribuídos espectralmente dos experimentos de mapeamento de peptídeos e clique em abrir no software DynamX e, em seguida, importe os arquivos brutos para o software DynamX. Depois de abrir o menu de dados, clique em Arquivos MS.
Para criar estados para cada condição proteica que está sendo estudada, clique em novo estado. Para adicionar cada ponto de tempo HDX, clique em nova exposição e clique em novo raw. Para importar arquivos brutos, arraste cada arquivo para a posição correta e clique em OK quando terminar.
Depois de atribuir automaticamente isótopos, faça a curadoria manual da atribuição isotópica para garantir a alta qualidade dos dados. Exporte os dados do cluster no arquivo csv com a ordem da coluna, conforme descrito no manuscrito. Abra o menu de dados no software de medição de massa e clique em dados de cluster de exportação.
Para análise de dados, primeiro carregue os dados agrupados exportados no software de análise HDX HDfleX. Para se adequar aos dados experimentais para todos os experimentos e estados, selecione os métodos apropriados de correção de back exchange para obter as constantes de taxa observadas para a reação HDX. Em seguida, calcule um limiar de significância global usando um método preferencial no HDfleX e realize testes de significância híbrida para determinar as diferenças significativas entre os estados em comparação.
O experimento de mapeamento da alfa-sinucleína gerou um mapa de cobertura de peptídeos que cobria 100% da sequência proteica com uma redundância média de 3,79. Além disso, este protocolo permitiu a geração de curvas de absorção de deutério para diferentes peptídeos de alfa-sinucleína, que foram então expressos como gráficos corrigidos por troca de costas e back exchange. Era evidente que a maior parte da troca de hidrogênio/deutério em alfa-sinucleína foi feita por um segundo.
A diferença conformacional entre os estados A e B de alfa-sinucleína também foi evidente a partir da maior absorção de deutério por estado B, tanto nos níveis de peptídeos quanto de aminoácidos. Para uma técnica tão sensível, é importante utilizar testes estatísticos robustos de significância ao comparar dados. Aqui, usamos nosso software HDfleX.
