Este protocolo permite a quantificação de gotículas lipídicas e a análise de sua morfologia e distribuição subcelular de forma específica do tipo fibra. Esta técnica permite o processamento simultâneo de diferentes músculos, economizando tempo e evitando artefatos que poderiam ocorrer quando processados de forma independente. Também permite a automatização da quantificação de gotículas lipídicas.
A miostetose foi avaliada nos músculos marinhos, mas esse protocolo poderia ser traduzido para humanos em diferentes condições, como obesidade, envelhecimento e câncer. Reconhecer as mesmas fibras na seção paralela pode ser difícil, mas estruturas notáveis como ajustes de axônio ou fusos musculares são bons marcos que ajudarão o pesquisador a localizar as mesmas fibras em ambos os slides. Para começar coloque duas seções vertigem congeladas em série da amostra muscular em dois slides de adesão pré-rotulados.
Um slide para determinar os tipos de fibras e o outro para quantificar o conteúdo lipídico. Para detecção imunohistoquímica do tipo de fibra muscular, cerque as seções com um contorno desenhado com uma caneta hidrofóbica. Coloque-o em uma câmara úmida e enxágue com pbs molar de gelo de 0,1 molar por um minuto em temperatura ambiente.
Em seguida, remova o PBS, adicione a solução de bloqueio ao slide e incuba por 90 minutos a 37 graus Celsius. Mais tarde remova a solução de bloqueio e incuba os slides por 90 minutos a 37 graus Celsius com a solução contendo os anticorpos primários. Lave os slides três vezes com PBS por cinco minutos cada, em temperatura ambiente.
Adicione a solução contendo os anticorpos secundários e incubar os slides no escuro por uma hora à temperatura ambiente, a partir de agora certifique-se de manter o slide longe da luz e proceda com as três lavagens em PBS por cinco minutos cada, em seguida, enxágue o slide em água dupla destilada, depois de remover o excesso de água, monte o slide com reagente antifado e armazene-o a quatro graus Celsius protegido da luz. Para colorar a gota lipídica com corpuleta, cerque a seção muscular com um contorno desenhado por uma caneta hidrofóbica antes de enxágüe-a com pbs molar gelado de 0,1 por 10 minutos. Ambos os slides devem ser manchados simultaneamente.
Fixar a seção com paraformaldeído frio de 4% sem metanol por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a primeira lavagem rápida, lave os slides três vezes com PBS por cinco minutos. Bloqueie o slide com soro de cabra 5% normal na PBS por uma hora na câmara humana.
Seguido pela incubação do slide com a solução do anticorpo primário que compreende 2% de soro de cabra normal e anti-laminina de rato na PBS por 90 minutos. Depois de lavar slides três vezes na PBS, realize a próxima incubação com a solução secundária de anticorpos contendo cabra, anti-rato, fluor Alexa 647 anticorpos em PBS à temperatura ambiente por uma hora. Certifique-se de que o slide está protegido da luz.
Após a incubação lave o slide três vezes com PBS. Em seguida, incubar a seção por 20 minutos com solução dapi e bodipy. Depois de uma lavagem rápida, lave três vezes com PBS e, uma vez com água destilada dupla, remova o excesso de água e monte a seção com um reagente anti-fade.
Uma vez que o músculo é escaneado, carregue as imagens digitais capturadas em qualquer software de processamento de imagem para reconstrução. Com base na morfologia das fibras e na histologia da seção muscular, salve a imagem em um formato adequado com todos os canais mesclados. Para observação e aquisição de imagem corporal, defina os parâmetros para um microscópio confocal, com uma lente objetiva de imersão de óleo de 40 X e uma abertura numérica de 1,4, conforme descrito no manuscrito.
Para evitar conversa cruzada entre bodipy e 558, 568, e laminin Alexa fluor 647; Use o modo de varredura sequencial no software confocal. Excite bodipy e 493,503 usando a linha laser de 488 nanômetros ou linha laser de argônio, e excite bodipy e 555.568 usando a linha de laser de 561 nanômetros. Finalmente, detecte o fluor 647 da Alexa laminina com uma linha laser de 640 nanômetros, dependendo do corante escolhido, estando as taxas de emissão em 570 a 650 nanômetros para bodipy e 493,503.
E entre 565 e 620 nanômetros para bodipy e 558.568. Defina a faixa de emissão de laminina em 656 a 700 nanômetros. Em seguida, defina o ganho e o ganho digital adequadamente para evitar detectar pixels saturados no indicador de intervalo.
Corrija o sinal de fundo ajustando o deslocamento. Para identificar o tipo de fibra no microscópio confocal, use um laptop no qual a imagem do slide previamente reconstruído com a detecção de imuno do tipo fibra pode ser verificada. Uma vez que um grupo de fibras é corretamente identificado, adquira a imagem com os canais bodipy e laminin.
Abra cada imagem com o auxílio do importador do bioformat de Fiji. Sob a pilha de visualização com opção selecione hipercompilhado, em seguida, modo de cor e padrão. Certifique-se de que a janela de escala automática esteja selecionada.
Use a ferramenta de seleção manual gratuita para selecionar manualmente o sarcolemma da fibra com base no canal laminin. E pressione T no teclado para gravar a região de interesse na janela do ROI. Vá para a janela principal de Fiji e clique em analisar e definir as medidas.
Em seguida, na área de seleção da janela pop-up e para diâmetro elevado, deixe as caixas restantes desmarcadas e outros parâmetros à medida que aparecem por padrão. Clique na medida na janela roi para obter a área e mínima para o diâmetro elevado da fibra selecionada e observe-as para uso posterior. Calcule o valor de um sexto do mínimo para o diâmetro elevado para delimitar a parte central da fibra.
Clique na janela do ROI, clique em adicionar para ter uma duplicata do primeiro ROI e selecione o segundo ROI que aparece na janela. Na janela principal de Fiji, clique em editar, em seguida, seleção e ampliar. Para introduzir o valor calculado anteriormente com um sinal de menos antes do número e clique em ok.
Na janela ROI, clique em adicionar, um terceiro ROI deve aparecer e excluir para excluir o segundo ROI. Na janela ROI selecione ambos os ROIs e clique em mais do que ZOR e adicione, aguarde que apareça um terceiro ROI que corresponda à periferia da fibra. Se for necessária a re-análise das mesmas fibras, salve os ROIs clicando em mais e depois salve.
Selecione o canal bodipy e abra a ferramenta limiar clicando nas guias de imagem, ajuste e limiar na janela principal de Fiji. Na janela pop-up limiar, defina os valores para 70 e 255. Em seguida, selecione o método YEN e preto e branco.
Antes de clicar em fundo escuro. Por fim, acerte a guia de aplicação. Vá para a janela principal de Fiji e clique em analisar e definir as medidas.
Na janela pop-up, selecione área, fração de área e limite para limiar. Deixe as caixas e parâmetros restantes como padrão. Vá para a janela do ROI e selecione o primeiro ROI.
Na janela principal de Fiji clique em analisar e, em seguida, analise a ferramenta de partículas. Na janela de partículas analisadas, defina os valores de dois ao infinito e verifique a caixa de pixels. Mantenha o valor de circularidade padrão e selecione resumir antes de clicar em ok.
Para obter os valores do centro e da periferia da fibra, repita a seleção do segundo e terceiro ROI de cada vez. Em seguida, salve os resultados clicando no arquivo e, em seguida, salve como na janela de resumo. Inclua o tipo de fibra no nome do arquivo.
Este protocolo imunohistoquímico permite o reconhecimento de camundongos, fibras oxidativas lentas, como as fibras tipo 1 e 2A, fibras glicolíticas rápidas, como os tipos 2X e 2B, e a presença de fibras híbridas. Medindo a área e o mínimo para o diâmetro elevado da fibra muscular foi aplicada uma redução dependente de tamanho para obter as áreas central e periférica de cada fibra. Estruturas notáveis de cada seção muscular, como galhos de axônio ou fusos musculares são bons marcos que podem ajudar a localizar as mesmas fibras de ambos os lados.
As configurações descritas para a aquisição de coloração de laminina corporal por microscopia confocal. Permitida, a visualização e análise do tamanho, número e distribuição de gotículas lipídicas de três a seis fibras simultaneamente. O método também permitiu a quantificação de três parâmetros importantes, a porcentagem da área de fibra ocupada pelas gotículas lipídicas, a densidade e o tamanho médio das gotículas lipídicas.
O procedimento de congelamento inadequado e a falha em alcançar a temperatura certa de isopentane resultaram em uma formação de cristal de gelo dentro das fibras musculares. Quando as seções não estavam alinhadas transversalmente a quantificação da gotícula lipídica e a comparação entre fibras, músculos ou animais não puderam ser realizadas. O processamento do segundo slide deve ser feito simultaneamente com o primeiro.
A secagem do ar após a crioseção por 15 minutos reduzirá significativamente o tamanho e o número de gotículas lipídicas. O bodipy pode ser usado para estudar a interação de gotículas lipídicas com outras organelas subcelulares, ou pilha de proteínas com fluorescência de um espectro diferente, ou com modelos de GFP geneticamente modificados. A miose tem sido relatada como um fator prognóstico ruim para várias doenças.
Portanto, essa técnica poderia ser utilizada para monitorar a progressão de uma doença ou para avaliar o efeito de um tratamento.
