Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung von Lipidtröpfchen und die Analyse ihrer Morphologie und subzellulären Verteilung in einer fasertypspezifischen Weise. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung verschiedener Muskeln, spart Zeit und vermeidet Artefakte, die bei unabhängiger Verarbeitung auftreten könnten. Es ermöglicht auch die Automatisierung der Lipidtröpfchenquantifizierung.
Myosteatose wurde in Meeresmuskeln beurteilt, aber dieses Protokoll konnte unter verschiedenen Bedingungen wie Fettleibigkeit, Altern und Krebs auf Menschen übertragen werden. Es könnte schwierig sein, die gleichen Fasern im parallelen Abschnitt zu erkennen, aber bemerkenswerte Strukturen wie Axonoptimierungen oder Muskelspindeln sind gute Orientierungspunkte, die dem Forscher helfen, die gleichen Fasern auf beiden Objektträgern zu lokalisieren. Legen Sie zunächst zwei serielle kryogefrorene Querschnitte der Muskelprobe auf zwei vorbeschriftete Adhäsionsobjektträger.
Ein Objektträger zur Bestimmung der Fasertypen und der andere zur Quantifizierung des Lipidgehalts. Für den immunhistochemischen Nachweis des Muskelfasertyps umgeben Sie die Abschnitte mit einem Umriss, der mit einem hydrophoben Pen gezeichnet wurde. Legen Sie es in eine feuchte Kammer und spülen Sie es mit eiskalten 0,1 molaren PBS für eine Minute bei Raumtemperatur ab.
Entfernen Sie als Nächstes den PBS, fügen Sie die blockierende Lösung zum Objektträger hinzu und inkubieren Sie 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie später die blockierende Lösung und inkubieren Sie die Objektträger für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius mit der Lösung, die die primären Antikörper enthält. Waschen Sie die Dias dreimal mit PBS für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Fügen Sie die Lösung hinzu, die die sekundären Antikörper enthält, und inkubieren Sie die Objektträger im Dunkeln für eine Stunde bei Raumtemperatur, stellen Sie anschließend sicher, dass der Objektträger vom Licht ferngehalten wird, und fahren Sie mit den drei Wäschen in PBS für jeweils fünf Minuten fort, spülen Sie dann den Objektträger in doppelt destilliertem Wasser ab, nachdem Sie das überschüssige Wasser entfernt haben, montieren Sie den Objektträger mit Antifadenreagenz und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius, geschützt vor Licht. Um das Lipidtröpfchen mit Bodipy zu färben, umgeben Sie den Muskelabschnitt mit einem Umriss, der von einem hydrophoben Pen gezeichnet wird, bevor Sie ihn 10 Minuten lang mit eiskaltem 0,1 molaren PBS spülen. Beide Folien müssen gleichzeitig gebeizt werden.
Fixieren Sie den Abschnitt mit kaltem vierprozentigem Paraformaldehyd ohne Methanol für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem ersten schnellen Spülen die Dias dreimal mit PBS für fünf Minuten waschen. Blockieren Sie den Objektträger mit 5% normalem Ziegenserum in PBS für eine Stunde in der menschlichen Kammer.
Anschließend wird der Objektträger mit der Lösung des primären Antikörpers, bestehend aus 2% normalem Ziegenserum und Ratten-Antilaminin in PBS, für 90 Minuten inkubiert. Nachdem Sie die Objektträger dreimal in PBS gewaschen haben, führen Sie die nächste Inkubation mit der sekundären Antikörperlösung, die Ziege, Antiratte, Alexa Fluor 647-Antikörper in PBS enthält, bei Raumtemperatur für eine Stunde durch. Stellen Sie sicher, dass die Folie vor dem Licht geschützt ist.
Nach der Inkubation den Objektträger dreimal mit PBS waschen. Als nächstes inkubieren Sie den Abschnitt für 20 Minuten mit dapi und bodipy Lösung. Nach einem schnellen Spülen dreimal mit PBS waschen und einmal mit doppelt destilliertem Wasser, dann entfernen Sie das überschüssige Wasser und montieren Sie den Abschnitt mit einem Anti-Fade-Reagenz.
Sobald der Muskel gescannt ist, laden Sie die aufgenommenen digitalen Bilder zur Rekonstruktion in eine beliebige Bildverarbeitungssoftware hoch. Speichern Sie das Bild basierend auf der Fasermorphologie und der Histologie des Muskelabschnitts in einem geeigneten Format, in dem alle Kanäle zusammengeführt sind. Stellen Sie für die Beobachtung und Aufnahme von bodipy Bildern die Parameter für ein konfokales Mikroskop mit einer 40-fachen Öl-Tauchobjektivlinse und einer numerischen Blende von 1,4 ein, wie im Manuskript beschrieben.
Um Übersprechen zwischen Bodipy und 558, 568 und Laminin Alexa Fluor 647 zu vermeiden; Verwenden Sie den sequentiellen Scanmodus der konfokalen Software. Excite Bodipy und 493, 503 mit der 488-Nanometer-Laserlinie oder Argon-Laserlinie und Anregung von Bodipy und 555, 568 mit der 561-Nanometer-Diodenlaserlinie. Schließlich erkennen Sie Laminin Alexa Fluor 647 mit einer 640-Nanometer-Diodenlaserlinie, je nach gewähltem Farbstoff, legen Sie die Emissionsraten auf 570 bis 650 Nanometer für Bodipy und 493, 503 fest.
Und bei 565 bis 620 Nanometern für Bodipy und 558, 568. Legen Sie den Emissionsbereich für Laminin auf 656 bis 700 Nanometer fest. Stellen Sie als Nächstes die Verstärkung und die digitale Verstärkung entsprechend ein, um zu vermeiden, dass gesättigte Pixel auf der Bereichsanzeige erkannt werden.
Korrigieren Sie das Hintergrundsignal, indem Sie den Versatz anpassen. Um die Art der Faser auf dem konfokalen Mikroskop zu identifizieren, verwenden Sie einen Laptop, auf dem das Bild des zuvor rekonstruierten Objektträgers mit der Fasertyp-Immundetektion überprüft werden kann. Sobald eine Gruppe von Fasern korrekt identifiziert ist, erfassen Sie das Bild mit den Bodipy- und Laminin-Kanälen.
Öffnen Sie jedes Bild mit Hilfe des Importeurs des Bioformats aus Fidschi. Wählen Sie unter dem Ansichtsstapel mit Option Hyperstapel, dann Farbmodus und Standard. Stellen Sie sicher, dass das Fenster Automatische Skalierung ausgewählt ist.
Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug für freie Hand, um das Sarkolemma der Faser basierend auf dem Lamininkanal manuell auszuwählen. Drücken Sie T auf der Tastatur, um den interessierenden Bereich im ROI-Fenster aufzuzeichnen. Gehen Sie zum Hauptfenster von Fidschi und klicken Sie auf Analysieren und Messungen einstellen.
Wählen Sie dann im Popup-Fenster den Bereich aus, und lassen Sie für den erhöhten Durchmesser die verbleibenden Kontrollkästchen deaktiviert und andere Parameter so, wie sie standardmäßig angezeigt werden. Klicken Sie im ROI-Fenster auf Messen, um den Bereich und das Minimum für den erhöhten Durchmesser der ausgewählten Faser zu erhalten, und notieren Sie sie für die spätere Verwendung. Berechnen Sie den Wert von einem Sechstel des minimal für den erhöhten Durchmesser, um den zentralen Teil der Faser abzugrenzen.
Klicken Sie auf das ROI-Fenster, klicken Sie auf Hinzufügen, um ein Duplikat des ersten ROI zu erhalten, und wählen Sie den zweiten ROI aus, der im Fenster angezeigt wird. Klicken Sie im Hauptfenster von Fidschi auf Bearbeiten, dann auf Auswählen und Vergrößern. Um den zuvor berechneten Wert mit einem Minuszeichen vor der Zahl einzugeben und klicken Sie auf okay.
Klicken Sie im ROI-Fenster auf Hinzufügen, Ein dritter ROI muss angezeigt werden, und löschen, um den zweiten ROI zu löschen. Wählen Sie im ROI-Fenster beide ROIs aus und klicken Sie auf mehr als ZOR und hinzufügen, warten Sie, bis ein dritter ROI angezeigt wird, der der Peripherie der Faser entspricht. Wenn eine erneute Analyse der gleichen Fasern erforderlich ist, speichern Sie die ROIs, indem Sie auf Mehr klicken und dann speichern.
Wählen Sie den bodipy-Kanal aus und öffnen Sie das Schwellenwertwerkzeug, indem Sie im Hauptfenster von Fidschi auf die Registerkarten Bild, Anpassung und Schwellenwert klicken. Stellen Sie im Schwellenwert-Popup-Fenster die Werte auf 70 und 255 ein. Wählen Sie dann YEN und Schwarz-Weiß-Methode.
Bevor Sie auf dunklen Hintergrund klicken. Klicken Sie abschließend auf die Registerkarte Anwenden. Gehen Sie zum Hauptfenster von Fidschi und klicken Sie auf Analysieren und Messungen einstellen.
Wählen Sie im Popup-Fenster Bereich, Flächenanteil und Schwellenwert begrenzen aus. Lassen Sie die verbleibenden Felder und Parameter als Standard. Gehen Sie zum ROI-Fenster und wählen Sie den ersten ROI aus.
Klicken Sie im Hauptfenster von Fidschi auf das Werkzeug Analysieren und dann auf das Werkzeug Partikel analysieren. Stellen Sie im Fenster Analysierte Partikel die Werte von zwei auf unendlich ein und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Pixel. Behalten Sie den Standardwert für die Zirkularität bei, und wählen Sie Zusammenfassen aus, bevor Sie auf OK klicken.
Um die Werte des Mittelpunkts und der Peripherie der Faser zu erhalten, wiederholen Sie jedes Mal die Auswahl des zweiten und dritten ROI. Speichern Sie dann die Ergebnisse, indem Sie auf Datei klicken, und speichern Sie dann im Zusammenfassungsfenster unter. Geben Sie den Typ der Verbindungslinie in den Namen der Datei ein.
Dieses immunhistochemische Protokoll ermöglicht die Erkennung von Mäusen, langsamen oxidativen Fasern wie Typ 1 und 2A, schnellen glykolytischen Fasern wie Typ 2X und 2B und dem Vorhandensein von Hybridfasern. Durch die Messung der Fläche und des minimal für den erhöhten Durchmesser der Muskelfaser wurde eine größenabhängige Reduktion angewendet, um die zentralen und peripheren Bereiche jeder Faser zu erhalten. Bemerkenswerte Strukturen jedes Muskelabschnitts, wie Axonzweige oder Muskelspindeln, sind gute Landmarken, die helfen könnten, die gleichen Fasern auf beiden Seiten zu lokalisieren.
Die beschriebenen Einstellungen für die Aufnahme von bodipy Laminin Färbung durch konfokale Mikroskopie. Erlaubt ist die Visualisierung und Analyse der Größe, Anzahl und Verteilung von Lipidtröpfchen von drei bis sechs Fasern gleichzeitig. Die Methode ermöglichte auch die Quantifizierung von drei wichtigen Parametern, nämlich dem Prozentsatz der Faserfläche, die von den Lipidtröpfchen besetzt ist, der Dichte und der durchschnittlichen Größe der Lipidtröpfchen.
Unsachgemäßes Einfrieren und das Versäumnis, die richtige Temperatur von Isopentan zu erreichen, führten zu einer Eiskristallbildung in den Muskelfasern. Wenn die Abschnitte nicht quer ausgerichtet waren, konnte die Lipidtröpfchenquantifizierung und der Vergleich zwischen Fasern, Muskeln oder Tieren nicht durchgeführt werden. Die Bearbeitung der zweiten Folie muss gleichzeitig mit der ersten erfolgen.
Wenn Sie den Objektträger nach der Kryosektion für 15 Minuten an der Luft trocknen, wird die Größe und Anzahl der Lipidtröpfchen erheblich reduziert. Bodipy kann verwendet werden, um die Wechselwirkung von Lipidtröpfchen mit anderen subzellulären Organellen oder Proteinstapeln mit Fluoreszenz eines anderen Spektrums oder mit gentechnisch veränderten GFP-Modellen zu untersuchen. Es wurde berichtet, dass Myosteatose ein schlechter prognostischer Faktor für mehrere Krankheiten ist.
Daher könnte diese Technik verwendet werden, um das Fortschreiten einer Krankheit zu überwachen oder die Wirkung einer Behandlung zu bewerten.
