Este protocolo destaca os principais passos para amplificar, diferenciar e criopreservar células epiteliais primárias. Em nossas condições culturais, as células epiteliais nasais primárias imitam o epitélio pulmonar. Isso permite culturas derivadas do paciente e estudos de medicina personalizados de células frescas ou biobancaradas.
As culturas epiteliais nasais derivadas do paciente podem ser usadas para avaliar a atividade do CFTR e ajudar na terapia de fibrose cística, avaliando a resposta individual do paciente a novas terapias. Demonstrando o procedimento estará Aurelie Hatton, uma engenheira do meu laboratório. Para começar, cresça células epiteliais nasais ou HNE, em 10 mililitros de meio de amplificação.
Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em um frasco revestido de colágeno de 75 centímetros quadrados até atingir 80 a 90% de confluência. Mude o meio a cada 48 a 72 horas. Mais tarde, lave as células com 10 mililitros de magnésio e DPBS livres de cálcio.
Aspire e descarte o soro fisiológico. Antes de adicionar dois mililitros de 0,25% trypsin e devolver o frasco à incubadora por oito a 12 minutos. Mais tarde, toque o frasco firmemente com uma palma para ajudar o desprendimento celular.
Adicione 10 mililitros do meio de amplificação para parar a reação enzimática. Enxágue vigorosamente o frasco usando uma pipeta de 10 mililitros para elaborar e expulsar o meio de amplificação sobre a superfície do frasco para enxaguar e desprender as células e coletar as células em um tubo de 15 mililitros. Centrifugar a suspensão celular a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o supernatante.
Suspenda a pelota em cinco a dez mililitros de meio de amplificação. Então conte as células em um hemótmetro. Após a contagem celular, centrifugar as células a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o supernasce.
Em seguida, suspenda novamente a pelota no meio de congelamento enriquecido para obter três a cinco vezes 10 às seis células por mililitro e coloque em um frasco de crio. Congele lentamente as células reduzindo a temperatura em aproximadamente um grau Celsius por minuto em um recipiente apropriado de criofreezing a menos 80 graus Celsius. No dia seguinte, mova a amostra preservada para um recipiente de armazenamento de nitrogênio para armazenamento a longo prazo.
Aqueça o meio de amplificação recém-preparado em um banho de água definido para 37 graus Celsius. Remova os frascos criográficos do tanque de armazenamento de nitrogênio e coloque-os rapidamente no banho de água, tomando cuidado para não submergir todo o frasco em água. Remova os frascos crioculos do banho de água quando permanecer apenas uma pequena gota congelada.
Limpe os frascos com 70% de álcool e coloque-os sob o capô. Usando uma pipeta de um mililitro, transfira as células descongeladas para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, adicione um mililitro de meio de amplificação quente de uma maneira em gota.
Após um minuto, adicione mais um mililitro de meio de amplificação e espere por um minuto. Adicione 10 mililitros de meio de amplificação e centrífuga a 500 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius. Aspire e descarte o supernaspe.
Suspenda a pelota em um volume de meio de amplificação necessário para alcançar uma densidade celular de uma vez 10 a seis células por mililitro. Depois de semear as células em um frasco revestido de colágeno de 25 centímetros quadrados, contendo meio de amplificação, incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Observe visualmente a expansão celular ao longo de dois a três dias antes de realizar a amplificação celular como demonstrado anteriormente.
Semente as células a uma densidade de 3,3 vezes 10 a quinta células por filtro em filtros porosos revestidos de colágeno de 0,33 centímetros quadrados, complementados com 300 microliters de meio de amplificação no lado apical e 900 microliters de meio líquido de ar no lado basolateral. Após três dias, aspire o meio apical e a cultura das células na interface ar-líquido por três a quatro semanas no meio ar-líquido para estabelecer um epitélio diferenciado. Troque o meio basal a cada 48 a 72 horas.
Células HNE frescas cultivadas na interface ar-líquido exibiam características típicas do epitélio respiratório polarizado e diferenciado. Nas 78 amostras de células HNE, as taxas de sucesso foram comparadas na escovação nasal semeada imediatamente e após um a sete dias de transporte em um meio de descarga. O percentual médio inicial de culturas bem sucedidas foi de 82% e atingiu 87% em amostras semeadas entre zero a cinco dias.
83% das amostras que se diferenciaram com sucesso em novas condições também foram bem sucedidas em amostras criopreservadas. Da mesma forma, em amostras que não se diferenciaram em condições frescas, 71% também não tiveram sucesso em condições de congelamento. Além disso, 50% das amostras congeladas entre duas a três vezes 10 a seis células por frasco criogeno não conseguiram crescer quando descongeladas, atingindo 80% por menos de duas vezes 10 às seis células.
Para a mudança de corrente de curto-circuito em resposta à mudança de corrente de forskolina e curto-circuito em resposta ao inibidor cftr 172 em células HNE tratadas por DMSO, não foi observada diferença significativa entre HNE descongelado fresco ou congelado. Após o tratamento, ambos os tipos de células apresentaram correção significativa com um aumento na mudança de corrente de curto-circuito em resposta à forskolina e uma diminuição na mudança de corrente de curto-circuito em resposta ao inibidor de CFTR 172. a resposta corretiva das terapias duplas da função CFTR foram avaliadas em comparação com as células HNE tratadas por DMSO, a mudança de corrente de curto-circuito em resposta à forskolina e em resposta ao inibidor CFTR 172 foram significativamente melhoradas tanto pelo VX-809 quanto pelo VX-770, quanto pelo VX-661 mais o VX-770.
Foram comparadas três terapias moduladoras de CFTR diferentes em HNE de seis pacientes homozigos F508del. Quando usado em combinação com um corretivo e potencializador CFTR, tanto o vértice quanto um modulador CFTR, corrigiu a mudança de corrente de curto-circuito em resposta à mudança de corrente de forskolina e curto-circuito em resposta ao inibidor CFTR 172 em uma medida semelhante. Ao congelar células HNE, é importante ter pelo menos 3 milhões de células por frasco criogeno para aumentar as chances de um bom resultado após o descongelamento.
A atividade de CFTR em células de HNE tem se mostrado um bom modelo preditivo para avaliar e ajustar terapias personalizadas na fibrose cística.
