Este protocolo descreve um alto rendimento de assimetria colorimétrica nas três etapas do ciclo de vida do Trypanosoma cruzi para identificar novos candidatos à doença de Chagas. Isso pode ser usado para identificar compostos trypanocidas de forma fácil, rápida e reprodutível. O procedimento será Romina Manarin, técnica de cultura celular de laboratório do laboratório de Pamela Crib.
Comece cultivando beta galactosidase expressando epimastigotes Trypanosoma cruzi em um frasco de cultura tecidual T-25 e incubar a 28 graus Celsius para cultingá-los axenicamente. Usando uma câmara de Neubauer, quantifique o crescimento dos parasitas antes de subculturar. Para a manutenção das culturas em fase de registro, a subcultura a cada 48 a 72 horas em cinco mililitros de meio LIT complementado com 10% de FCS e geneticina em sulfato em uma concentração final de 200 microgramas por mililitros.
Em seguida, feche firmemente a tampa antes de incubar a 28 graus Celsius em uma posição vertical. A partir da cultura da fase de registro, faça uma suspensão de epimastigote em meio LIT suplementado com geneticina e sulfato na concentração final de 200.000 células por epimastigote mililitro por mililitro. Depois de dispensar 100 microliters de suspensão por poço de uma placa de 96 poços, maquiagem volume final de bem 200 microliters com médio.
Faça a suspensão da célula Vero em DMEM suplementada com 2% de FCS na concentração final de 100.000 células por mililitro. Semente 100 microliters da suspensão por poço em uma placa de cultura de tecido de 96 poços. Incubar as células durante a noite para adesão e, no dia seguinte, observar as células sob o microscópio.
No dia seguinte, enxágue a monocamada celular Vero três vezes com 100 microliters de PBS estéreis. Adicione tripolas metacíclicas obtidas anteriormente. Adicione uma multiplicidade de infecção ou MOI de 10-1 em 100 microliters de DMEM suplementados com 2% de FCS por poço e incubar por seis horas, como demonstrado anteriormente.
No final da incubação, lave a placa duas vezes com PBS e adicione 100 microliters de DMEM sem fenol vermelho complementado com 2% de FCS. Depois de fazer a suspensão das células Vero no DMEM adicionar a concentração final de 1 milhão de células por mililitro. Sementes 800.000 células em cinco mililitros do meio em frascos T-25 e incubar durante a noite para a adesão celular.
Uma vez que o frasco é enxaguado com PBS, adicione tripmonstigotes, adicione um MOI de 10-1 em cinco mililitros de DMEM complementados com 2% DE FCS e incubar durante a noite como demonstrado anteriormente. No final da incubação, lave o frasco duas vezes com PBS. Adicione cinco mililitros de DMEM fresco suplementado com 2% de FCS e incubar por quatro dias.
No final da incubação, depois de observar o supernatante para trippomastigotes presença sob um microscópio óptico. Quantifique os trypomastigotes usando uma câmara de Neubauer. Colete o supernatante em um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 7.000 vezes G durante 10 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, descarte o supernasce e resuspenque a pelota em DMEM sem fenol vermelho complementado com 2% de FCS para obter uma concentração de 1 milhão de tripmonotes por mililitro. Semente 100 microliters da suspensão trypomastigote por poço em uma placa de 96 poços. Adicione solução de benznidazol a epimastigotes, células Vero com amastigotes, ou tripulações como descrito no manuscrito do texto.
Em seguida, incubar os epimastigotes, definir 28 graus Celsius por 72 horas e os tripulações ou células Vero infectadas com amastigotes por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono. Para o ensaio coloridométrico, configure os poços em branco adicionando 100 microliters de PBS ou meio correspondente. Em seguida, adicione 40 microliters de solução de substrato CPRG e 10 microliters da solução detergente para cada poço para obter uma concentração final de 200 CPRG micromolar e 0,1% detergente em um volume final de 250 microliters em cada poço.
Após a incubação, a 37 graus Celsius por duas horas, meça a absorvência em 595 nanômetros usando um espectrômetro de microplato. No software, crie um novo protocolo selecionando a absorvância como método de detecção e ponto final como o tipo de leitura e clique em ok. Em seguida, adicione um passo de leitura.
Digite o comprimento de onda selecionado e clique em ok. Na seção de layout da placa marque os poços a serem lidos, clique bem e clique na placa de leitura, aguarde que os valores apareçam na tela e exporte-os para uma planilha para analisar os resultados e calcular os valores de absorção usando subtração conforme descrito no manuscrito. Em software de análise estatística, plote a concentração de BZN versus a absorvância em 595 nanômetros na tabela XY.
Transforme as concentrações do BZN em valores logarítmicos clicando em analisar, selecionando a opção transformar e clicando bem. Para obter valores IC50, clique em analisar e, a partir da lista de análise XY, selecione ajuste de curva de regressão não linear e clique em ok. Em seguida, vá para a janela de parâmetros, na guia modelo, vá para o grupo de inibição de resposta de dose de equações incorporadas, selecione inibidor de log versus inclinação variável de resposta para parâmetros como o método de resposta da dose deixar todas as outras guias em valores padrão e, em seguida, clique, ok.
Clique na seção resultados para encontrar o valor IC50, o SD e a bondade do ajuste. Clique na seção gráfico para encontrar o gráfico XY da concentração logarítmica da droga versus os valores de absorção e certifique-se de que o ajuste da curva também seja grafado em uma cor diferente. No presente estudo, o valor ic50 obtido para epimastigotes foi de aproximadamente 20 micromolar, semelhante aos estudos anteriores.
Além disso, os resultados indicaram a atividade beta do liner dos epimastigotes ao longo do tempo. É muito importante realizar pelo menos réplicas de cada condição testada e erros minimizados no gerenciamento de volumes.
