Produção de nanopartículas lipídicas carregadas de siRNA usando um dispositivo microfluido

O tamanho da nanopartícula lipídica afeta a biodistribução, o efeito anti-tumor e o desempenho do silenciamento genético. Portanto, o método de controle de tamanho lnp é uma técnica eficaz para a produção de nano medicamentos, incluindo sistemas de entrega de RNA. Este dispositivo microfluido original, chamado dispositivo iLiNP, foi capaz de controlar o tamanho do LNP variando de 20 a 100 nanômetros em intervalos de 10 nanômetros.

O dispositivo iLiNP pode produzir não apenas LNPs carregados de siRNA, mas todos também LNPS carregados de mRNA, e LNPs carregados de ribonucleoproteína. Para começar, pegue as soluções de etanol lipídudo e produza os LNPs carregados de siRNA misturando soluções DOTAP, DSPC, colesterol e DMG-PEG2k a uma relação molar de 50 a 10 a 38,5 a 1,5. Ajuste a concentração lipídica total para oito milimiliar.

Em seguida, pegue as soluções aquosas de soro fisiológico de 154 milimil e tampão de acetato de 25 milialares no pH 4 e filtre-as através de filtros de membrana de 0,2 micrômetros ou filtros de seringa. Prepare a solução de tampão siRNA dissolvendo 70 microgramas de siGL4 em um mililitro de tampão de acetato de 25 milimil. Encha uma seringa de vidro mililitro com soluções lipídicas e aquosas, respectivamente.

Conecte as seringas de vidro ao pico de capilares usando conectores de seringa, em seguida, defina a taxa de fluxo das soluções lipídicas e aquosas e introduza as soluções lipídicas e aquosas separadamente no dispositivo iLiNP usando bombas de seringa. Colete as suspensões do LNP em um microtubo da tomada do dispositivo iLiNP. Dialisar a suspensão do LNP usando uma membrana de diálise de 12 a 14 quiloDalton cortes de peso molecular a quatro graus é Celsius durante a noite contra soro fisiológico ou DPBS para LNPs POPC e LNPs carregados de sirna, respectivamente.

Colete as suspensões dialisados do LNP em microtubos e, em seguida, pipet 20 a 30 microliters da suspensão LNP para uma célula micro quartzo. Finalmente, meça o tamanho do LNP, a distribuição do tamanho do LNP e o índice de poli dispersão por dispersão dinâmica de luz. A distribuição do tamanho do POPC LNP produzida em diferentes condições de fluxo, como a taxa de fluxo total e as taxas de fluxo são mostradas aqui.

Tamanhos precisos do LNP que variam de 20 a 100 nanômetros podem ser controlados usando este dispositivo iLiNP. LNPs de pequeno porte são formados em altas condições de fluxo total. Além disso, os tamanhos do LNP que são formados na FRR 5 são menores do que os da FRR 3, independentemente da taxa de fluxo total.

A distribuição de tamanho dos LNPs carregados de siRNA é mostrada aqui. siRNAs são encapsulados nos LNPs por interação eletrostática entre o DOTAP lipídico e os siRNAs carregados negativamente. O dispositivo iLiNP produziu LNPs cationic carregados de 90 nanômetros com uma distribuição estreita.

A eficiência de encapsulamento do siRNA foi de 95% devido à interação eletrostática entre o lipídio cationico e os siRNAs carregados negativamente. Citotoxicidade e a atividade de silenciamento genético dos LNPs carregados de siRNA de 19 nanômetros foram avaliados. LNPs carregados de siRNA mostraram citotoxicidade em uma dose de 10 a 100 siRNA nanomolar.

O nível de expressão da luciferase foi diminuído dependendo da concentração de siRNA. O SiRNA carregado LNPs suprimiu 80% de expressão de luciferase a uma dose de 100 siRNA nanomolar. As otimizações das condições de fluxo são os passos mais importantes no protocolo para obter os LNPs de tamanho desejado.

O método de produção de LNP baseado em microfluido, incluindo o dispositivo iLiNP, não requer nenhum procedimento complicado e espera-se que seja empregado como o método padrão de produção do LNP.