A espectroscopia de correlação transversal de fluorescência é um método estatístico que usa fluorescência de resultado do tempo para identificar a assinatura dinâmica de receptores acoplados à proteína G em células vivas. Aqui, estamos particularmente interessados.em receptores beta-2 adrenérgicos. Os receptores sphingolipid fornecem principalmente informações sobre a dinâmica de difusão translacional e com a ajuda da anisotropia fluorescência também difusão rotacional.
Ao introduzir um rótulo adicional, também podemos promover alterações pró-vinculação ou até mesmo conformacionais se promover a transferência de energia de ressonância entre os rótulos conforme sondado. Fluorescência de tempo quantitativo requer um alinhamento cuidadoso das medidas de configuração e calibração. Nos minutos seguintes, forneceremos um guia experimental para espectroscopia de correlação de fluorescência de células de vida, espectroscopia de correlação cruzada e transferência de energia de ressonância forster de receptores acoplados à proteína G, usando etiquetas clones e força de fluxo sintético.
A sessão celular e a transfixação precisam ser realizadas em condições estéreis. Coloque uma barra de deslizamento de tampa limpa em uma placa de seis poços, e lave-a com soro salino tampão de fosfato estéril adicione dois mL de cultura celular com vermelho fenol suplementado com soro bovino 10% fetal, 100 microgramas, per amina penicilina e 100 microgramas por ml streptomicina para cada poço, e mantê-lo de lado. Pegue as células CHO que são cultivadas no mesmo meio com vermelho fenol a 37 graus centígrados em 5% de CO2 e lave-as com cinco mL PBS para remover as células mortas.
Adicione dois mL de trippsina e incubar por dois minutos em temperatura ambiente. Diluir as células de dados com oito mL de meio com fenol vermelho e misturar cuidadosamente por pipetação. Conte as células em uma câmara de Neubauer e sente as células a uma densidade de 150.000 células por poço na placa de seis poços contendo o deslizamento de cobertura.
Deixe as células crescerem em uma incubadora por 24 horas, a fim de alcançar aproximadamente 80% de confluência. Diluir dois microgramas do DNA vetorial desejado. Por exemplo, CT SNAP ou NT SNAP, e seis microliteres desse reagente de transfecção em dois tubos separados.
Cada um contendo 500 microliter reduziu o meio sérico para cada poço e incuba-os por cinco minutos em temperatura ambiente. Misture as duas soluções para obter a mistura de transfecção e incuba-la por mais 20 minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, lave as células CHO sentadas uma vez com PBS estéril.
Substitua o PBS por um ml por poço de meio livre de fenol vermelho, suplementado com soro bovino 10% fetal e sem antibióticos. Adicione toda a mistura de construção de uma ml gota sábia a cada poço e incubar as células durante a noite a 37 graus em 5% de CO2. Para rotulagem, dilui o substrato SNAP apropriado em um mL médio suplementado com soro bovino fetal de 10% para obter uma concentração final de um micromolar.
Lave as células transfeminadas uma vez com PBS e adicione um mL por poço de uma solução de substrato SNAP micromolar. Incubar as células por 20 minutos a 37 graus em 5% de CO2. Lave as células três vezes com o meio livre de fenol vermelho, e adicione dois mL por meio livre de fenol.
Incubar as células por 30 minutos a 37 graus centígrados em 5% de CO2. Transfira o deslizamento de cobertura de todas as amostras posteriormente para a câmara de imagem e lave com 500 tampão de imagem Microliter. Adicione 500 tampão de imagem de microliter antes de passar para a configuração FRED FCS.
A configuração FRED FCS é equipada com um objetivo de água de microscopia confocal, duas linhas laser, um sistema de contagem estrangeira única de quilter, dois BMTs híbridos e duas ações para coleta de fótons e o software de coleta de dados. É muito crucial alinhar a configuração toda vez antes da medição em células vivas. Para ajustar o foco, o orifício e a posição de coloração, coloque duas soluções de calibração verde nanomolar em um deslizamento de tampa de vidro e ligue o laser de 485 nanômetros e 560 nanômetros operados em estacas, excitação intercalada ou modo PI.
Concentre-se na solução e ajuste a posição do anel de pinhole e do colarinho de modo que a maior taxa de contagem e o menor volume confocal sejam obtidos para obter o brilho molecular máximo. Repita este processo para os canais vermelhos com 10 soluçãos de calibração vermelha nanomolar e uma mistura de ambos. Coloque 10 solução de DNA nanomolar no deslizamento de tampa de vidro e ajuste o foco do orifício e a posição do anel da gola de modo que as cores cruzadas entre os canais de detecção verde e vermelho seja mais alta.
Essa é a fonte da maior amplitude. Para medições em células vivas, encontre uma célula adequada limitando-se com a lâmpada marcadora e observando através do ocular. Ligue os lasers no modo PI e foque na membrana procurando as contagens máximas por segundo.
Por favor, note, a potência do laser pode precisar ser reduzida para as amostras de células. De preferência menos de cinco microwatts no objetivo. Isso depende muito do floral usado e da configuração.
Observe as curvas auto e cross coll do AR beta-2 vinculado ao EGP e snap tag probes na pré-visualização on-line do software de coleta de dados e colete várias medidas de classificação com um tempo de aquisição entre 60 e 180 segundos. Exporte o curso de correlação e contraste de todas as medidas. Tome cuidado aqui para definir corretamente as janelas de tempo de solicitação e atraso e use alguma opção de obtenção de micro tempo no software de correlação de dados.
No total, são necessárias três correlações diferentes. Correlação automática da janela de tempo do canal verde. Correlação automática dos canais vermelhos e da janela de tempo de atraso.
E finalmente a correlação cruzada do sinal do canal verde, e a janela de tempo imediata foi o sinal do canal vermelho na janela de tempo de atraso. Aqui estão as funções de correlação automática do FRED verde e vermelho para soluções e encaixá-las a um modelo de difusão de 3 DT com um termo trigêmeo adicional necessário para calibrar a forma e o tamanho do volume de detecção confocal para os dois canais de cores de uso, onde B é a linha de base da curva e o número de moléculas e foco, TD o tempo de difusão e S, o zero sobre ômega zero o fator de forma do elemento de volume confocal. O piscar trigêmeo e a física fotográfica é descrito como amplitude AR e tempo de relaxamento TR. Use o coeficiente de difusão conhecido para os destaques de calibração verde e vermelho e obtenha fatores de forma para determinar as dimensões e o volume do elemento de volume confocal infeccioso.
Calcule o espectro como IFR, o sinal fluorescente verde coletado nos canais zeros, e dois no canal de detecção certo, canal um e três, como uma razão do fundo coletado sinais. Determine a expectativa direta do fluxo de dados aceitadores pelos comprimentos de onda de excitação do doador pela razão do contraste coletado do fundo das medidas de calibração vermelha e a excitação da janela de tempo imediata pelo laser verde para a conta correta de fundo diretamente na excitação da janela de tempo de atraso pelo laser vermelho. Calcule o brilho molecular de B tanto a força de fluxo verde e vermelho com base no contraste coletado em segundo plano, quanto para obter o número de moléculas e foque no ajuste de difusão de 3 DT.
Encaixar ambas as correlações ultra do canal verde e vermelho, bem como através da correlação do prompt verde e do atraso vermelho do DNA de nível duplo para o modelo de difusão de 3 DT mantém os fatores em forma de obtenção constantes para as funções de correlação automática. O fator de forma para as funções de correlação cruzada é geralmente entre esses dois valores. Determine a amplitude em tempo de correlação zero com base nos valores da fonte do número aparente de moléculas e foco.
Calcular a razão de amplitude para uma amostra foi uma co-difusão de 100% da força do piso verde e vermelho. Coloque as amostras de células em um modelo apropriado. Como eles são mostrados difusão receptor de membrana não é curioso de uma forma bi-modal foi um curto, sem tempo de difusão longa.
Além disso, a física fotográfica e piscando para fora da força do chão devem ser considerados. Aqui para TD1 e TD2, estão os dois necessários para os tempos de difusão. E uma é uma fração do primeiro tempo de difusão Em contraste com a medição de calibração em que os dados livres e fios de DNA se difundem, em todas as direções, os receptores de membrana mostram apenas a difusão 2D ao longo das membranas celulares calcula a concentração de proteínas de rótulo verde ou vermelho a partir do respeito do número de moléculas e foco.
E o volume do elemento de volume confocal, usando massa tendenciosa. Ajuste as duas correlações de alto da amostra dupla rotulada usando o mesmo modelo do construto de nível único e a função de correlação cruzada usando um modelo de difusão bimodal, Nota para uma descrição global do sistema. Todas as três culturas têm que estar em forma em conjunto.
O termo de difusão é idêntico para as três culturas. E a única diferença é que o tempo de reputação cai, a função de correlação cruzada. Calcule a concentração de proteínas de trabalho verde ou vermelho a partir do respectivo número de moléculas e foco e o volume do elemento volume confocal.
Estimar a fração ou concentração de proteínas de rótulo verde e vermelho interagindo das amostras de células utilizando os fatores de correção obtidos a partir das amostras de DNA, as razões de amplitude da amostra celular e as respectivas concentrações obtidas. Ajuste as duas correlações alteradas da amostra FRED como uma única amostra rotulada e a correlação frontal com um modelo de difusão bimodal contendo um termo anti correlação, onde a AF reflete a amplitude da correlação total e AR e TR o respectivo tempo de amplitude e relaxamento. No caso de alterações de fluorescência anti-correlacionada devido a fred um ou vários termos anti correlação podem ser necessários, o que resultou em um mergulho da função de correlação cruzada fred em tempos de baixa correlação coincidindo com um aumento nas duas funções de correlação automática.
As medidas de calibração das soluções florais verdes e vermelhas para barbear fatores de 6,5 e os canais verdes, e 6,8 nos canais vermelhos. Assim, o volume confocal tem o tamanho de 1,4 e 1,9 femto mais tarde neste dia de medição, o brilho da molécula está em 12,5 quilohertz por molécula, e 2,6 quilohertz por molécula. Temos 15% de crosstalk do floral verde para os canais vermelhos após excitação de doadores e 38% de excitação direta, exceto excitação da forma floral vermelha pelo verde, a partir de nossa medição de DNA, determinamos os fatores de correção para o volume de sobreposição confocal para 0,6 e 0,7 também, as células transfeinadas com um único rótulo construto mostram difusão bimodal bi-modal bidimensional na membrana celular onde cerca de metade das moléculas se difundem lentamente em a escala de tempo de 50 a 100 milissegundos e a outra metade relativamente rápida em torno de dois milissegundos em ambas as construções.
Além disso, o piscar trigêmeo está presente. No entanto, no snap de nível vermelho, construa outro tempo de relaxamento é adquirido em 180 microsegundos, o que pode decorrer de unbound snap straight. A partir do rótulo duplo em si, transectado com a construção anti snap onde os dois rótulos em dois lados diferentes da membrana celular, duas medidas a menos foram coletadas o ruído e a camada vermelha sobre a correlação.
E a correlação da cruz pi é bastante alta aqui. Aqui 70% das moléculas, se você lentamente abaixo de cem milissegundos de escala de tempo, e apenas 30% rápido em torno de um milissegundo, a fração de moléculas duplas liberadas é baixa e fica entre 15 a 25% Os dados para o snap ct parecem melhores e menos barulhentos. No entanto, a aproximação anti mais profunda esperada não pode ser vista e é provavelmente massa pela alta quantidade de crosstalk, aceitação direta excitação e piscar trigêmeos de força floral, e uma vez que os esquemas de análise de dados aproveitando a intensidade de fluorescência coletada DKS podem ajudar a resgatá-lo como mostrado para o conjunto de dados simulados.
A vantagem da técnica Fred FCS é que, juntamente com a mobilidade, podemos investigar a dinâmica da conferência dos GPCRs. No entanto, realizar FCs FRED em laboratórios é desafiador e solicitar boas células transfetaturadas, rotulagem eficiente e uma configuração calibrada perfeita. Apenas um par FRED pro force também é muito crucial.
As etapas experimentais críticas incluem a otimização da otimização da transfecção, a minimização do plano de fundo e a fluorescência automática. Além disso, o pipeline de análise de Átomos ajudará a entender a dinâmica de várias dinâmicas dos preceptores em células vivas. Esperamos que este protocolo seja útil para executar a abordagem FRED FCS em experimentos de células vivas.
