Este protocolo descreve os passos para induzir inflamação ocular confiável e robusta usando micobactérias mortas pelo calor no modelo de camundongo. Este modelo de uveíte micobacteriana preparada pode ajudar a estudar os mecanismos de inflamação ocular crônica imunomediada que se desenvolve após uma infecção micobacteriana. Este modelo de uveíte crônica não requer o uso de cepas específicas de camundongos ou imunização com antígenos oculares.
Este modelo facilita o uso de linhagens de camundongos transgênicos e knockout genéticos em estudos mecanicistas da patogênese da inflamação ocular. Este modelo de PMU será útil em estudos que testam novas terapias para inflamação ocular ou uveíte em humanos. Tratamentos como novos colírios ou agentes imunomoduladores administrados sistemicamente podem ser testados quanto à eficácia com este modelo.
Este modelo facilitará o estudo de como os antígenos micobacterianos mortos pelo calor alteram o microambiente de um órgão imunoprivilegiado como o olho. Esses resultados também podem fornecer insights sobre como outros tipos de infecção ocular afetam o olho ou como locais privilegiados imunológicos, como o cérebro, respondem a antígenos microbacterianos. Para começar, desprenda o corpo da unidade conversora Sonicator e limpe a sonda com um cotonete de álcool a 70%.
Em seguida, ligue o Sonicator e ajuste a configuração de energia para quatro, girando o botão de controle de energia. Em seguida, para gerar uma suspensão fina da microbactéria tuberculose H37Ra na PBS, mergulhe a ponta da sonda no pó microbacteriano contendo PBS. Sonicate a mistura no gelo por 30 segundos, em seguida, pause por 30 segundos e repita por um total de cinco minutos para dispersar totalmente o pó em uma suspensão uniforme sem aquecer o líquido.
Em seguida, adicione 2,5 mililitros de Adjuvante Incompleto de Freund à mistura e repita o processo de sonicação no gelo até que a emulsão forme uma consistência semelhante à pasta de dente. Para a injeção subcutânea, carregue 200 a 300 microlitros da emulsão microbacteriana em uma seringa de um mililitro. Expulse o ar da seringa e continue a encher a seringa com inversão intermitente e batida até encher.
Em seguida, coloque as injeções subcutâneas na superfície dorsal dos quadris ou na superfície ventral das pernas proximal à região dos gânglios linfáticos inguinais de um camundongo C57 preto 6J anestesiado de 6 a 10 semanas de idade. Insira cuidadosamente a agulha, tomando cuidado para não penetrar no músculo, e injete 50 microlitros da emulsão no espaço subcutâneo. Não remova a agulha imediatamente para permitir que a emulsão espessa seja totalmente injetada.
Para preparar o estoque de antígeno para a injeção intravítrea, sonicate o H37Ra em solução PBS como demonstrado anteriormente, em seguida, alíquota da solução em volumes de 100 microlitros e armazenar a 20 graus Celsius. No dia da injeção, após confirmar a profundidade da anestesia geral, anestesiar a córnea com uma gota de tetracaína a 0,5% e dilatar a pupila com uma gota de fenilefrina a 2,5%. Depois de eliminar o excesso de líquido, adicione uma gota de 5% de betadine à superfície do olho e ao cabelo circundante para diminuir o risco de endoftalmite.
Após dois a três minutos, remova o Betadine e cubra o olho com gel de hipromelose a 0,3% para evitar o ressecamento sob anestesia e a formação de catarata. Em seguida, carregue uma seringa de 10 microlitros com a mistura de antígeno e fluoresceína, em seguida, coloque o mouse em uma posição prona na plataforma e use as barras auriculares direita e esquerda para fixar a cabeça do mouse. Posicione e oriente o rato sob o escopo para que o aspecto nasal superior do olho direito seja visível.
Em seguida, usando uma agulha de calibre 30, desloque os cílios, exponha a esclera e visualize o limbo e o vaso sanguíneo radial. Em seguida, usando uma agulha estéril de calibre 30, faça um orifício de guia na esclera de um a dois milímetros após o limbo. Em seguida, insira a agulha de calibre 34 presa ao suporte da injeção no olho, através do orifício guia, em um ângulo que evite a lente, mas coloque a ponta da agulha na cavidade vítrea.
Usando um controlador de bomba de microseringa, injete cuidadosamente um microlitro do extrato de M.tuberculosis na cavidade vítrea. Em caso de refluxo consistente, aumente o volume de injeção para 1,5 microlitros para garantir a administração adequada da dose. Confirme a colocação intravítrea visualizando um reflexo esverdeado no olho e, após 10 segundos, remova a agulha do olho.
Depois de anestesiar o rato, dilate a pupila com uma gota de fenilefrina a 2,5%, evitando o excesso de gotículas que entram no nariz ou na boca. Após dois a três minutos, retire o excesso de líquido e cubra o olho com gel de hipromelose a 0,3%. Em seguida, envolva o rato em uma camada de gaze cirúrgica para manter o calor do corpo, em seguida, coloque o rato no do animal e posicione a cabeça com a barra de mordida.
Para adquirir a tomografia de coerência óptica ou imagens OCT, ligue o sistema de imagem OCT e abra o software de imagem. Para imagens de câmara posterior, aproxime a OCT da superfície do olho, tomando cuidado para não colocar a superfície da lente em contato com o olho. Quando o olho estiver posicionado corretamente, pare a varredura rápida, selecione o protocolo de varredura por volume e ative a varredura com a opção Apontar.
Para imagens de segmento posterior, ajuste até que o nervo óptico esteja centrado na imagem de alinhamento de varredura B horizontal e a retina esteja alinhada com o eixo de alinhamento vertical. Para imagens de segmento anterior, ajuste a posição para centralizar o ápice da córnea na imagem de alinhamento horizontal de varredura B e na imagem de alinhamento de varredura B vertical. Finalmente, clique em Instantâneo para capturar a imagem de digitalização do volume e, em seguida, clique em salvar.
24 horas após a injeção intravítrea, as células inflamatórias são observadas no aquoso e vítreo. Edema de córnea, hipópio e múltiplas células inflamatórias flutuantes livres são observados na câmara anterior e vitrite na câmara posterior. O grau de inflamação ocular pode ser pontuado nessas imagens OCT.
Pontuações combinadas maiores que zero, mas menores que 2,5, representam inflamação leve. Pontuações superiores a 2,5, mas inferiores a 4,5. representam inflamação moderada e escores superiores a 4,5 identificam inflamação grave.
Os escores de inflamação também podem ser determinados usando cinco características visíveis em seções de coloração de hematoxilina e eosina. O escore de gravidade é determinado pela contagem do número de células inflamatórias no aquoso e vítreo. A imagem longitudinal do fundo de olho de Brightfield também pode identificar inflamação retiniana e perivascular.
Olhos gravemente inflamados demonstram múltiplos infiltrados brancos na retina e tortuosidade vascular na imagem do fundo de boca, bem como vitrite densa e edema da retina na OCT no segundo dia. Olhos levemente inflamados demonstram menos e mais discretas lesões lineares no fundo de olho e várias células infiltrantes no espaço vítreo. Garantir a consistência durante as injeções subcutâneas e intravítreas e tomar as medidas apropriadas para prevenir o desenvolvimento de endoftalmite infecciosa são os principais passos que ajudam a replicar com sucesso este modelo.
A imagem de bioluminescência in vivo pode ser usada para caracterizar a inflamação, enquanto ensaios post-mortem, como a análise citométrica de fluxo multiparâmetro, podem ser realizados para identificar e quantificar populações de células imunes infiltrantes. A análise de citocinas, o sequenciamento de mRNA e a imagem de imunofluorescência podem ser usados para avaliar padrões de expressão gênica e proteica ou identificar populações de células imunes da retina na uveíte. Este protocolo mostra como realizar injeções reprodutíveis, assépticas e minimamente traumáticas que ajudarão os futuros investigadores a acessar o espaço intravítreo em camundongos.
A OCT também desempenhará um papel importante na detecção de inflamação ocular que, de outra forma, poderia ser perdida por um exame visual dos olhos de pequenos animais experimentais.
