Este protocolo emprega microscopia de super-resolução, especificamente microscopia de reconstrução óptica estocástica direta, também conhecida como dSTORM, para contornar o limite de difração e visualizar EVs com precisão de nanômetro em três dimensões. Uma vantagem notável do dSTORM é sua capacidade de visualizar diretamente partículas sob o nível de difração de luz sem danificar etapas que alteram a natureza bioquímica do EV. Muitos vírus evolutivamente distintos empregam sinalização EV, portanto, o dSTORM pode ser empregado para caracterizar EVs para biomarcadores de doenças e progressão, bem como para visualizar partículas de vírus individuais, como SARS-CoV2. Comece colocando vesículas extracelulares purificadas de afinidade, ou EVs, em vidro-fundo, microslídeo, oito poços em um volume total de 200 microliters, e permita-lhes aderir à superfície durante a noite a quatro graus Celsius.
Sem remover a solução existente da placa de oito poços, fixe os EVs nas placas adicionando 200 microliters de 4% de paraformaldeído em 1X PBS à solução contendo EV em cada poço e deixe as placas incubarem por 30 minutos à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente a solução paraformaldeída e o excesso com uma micropipette para não perturbar os EVs. Lave o EV com 1X PBS para remover o excesso de paraformaldeído.
Realize o procedimento de lavagem três vezes. Remova o excesso de 1X PBS. Prepare 250 microliters de solução tampão dSTORM Bcubed por amostra, criando uma solução de dioxicase protocatecaxa de cinco milimolar diluída em tampão de imagem de acordo com o protocolo do fabricante.
Adicione 250 microliters do buffer preparado para cada um, bem como de acordo com o protocolo do fabricante, e incubar as placas por 20 minutos à temperatura ambiente antes de fotografar para escovenge moléculas oxidantes. Os EVs podem ser visualizados imediatamente ou armazenados a quatro graus Celsius por uma semana. Para preparar as contas necessárias para a calibração do microscópio de super resolução, dilui as microesferas de 100 nanômetros para uma concentração de 0,5% na água de grau de biologia molecular, e pipetas 200 microlitros em cada poço de uma placa de fundo de vidro, microslídeo, oito poços.
Deixe as contas se instalarem nos poços por uma hora em temperatura ambiente. Sem remover a solução existente, adicione 200 microliters de 4% de paraformaldeído em PBS a cada poço à solução de contas de calibração, e deixe incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o paraformaldeído com uma micropipette para não perturbar as contas e lave as contas três vezes com PBS 1X.
Prepare o tampão como descrito no manuscrito. Remova 1X PBS e adicione 250 microliters do buffer preparado a cada poço. Deixe o buffer descansar por 20 minutos antes da visualização.
Use o botão Conectar o microscópio para conectar ao microscópio 3D antes de colocar qualquer coisa no palco. Adicione óleo 100X ao objetivo, e coloque o centro do poço em cima do objetivo. Na configuração Acquire, ligue os lasers de excitação de 473 e 640 nanômetros e clique em Exibir.
Sem ativar a lente 3D, visualize as contas sob a configuração de saturação de fótons clicando nas contagens de fótons nas Opções de Exibição de Imagem. Defina os poderes de laser iniciais para 8,4 miliwatts para o laser de 473 nanômetros, e 11,6 miliwatts para o laser de 640 nanômetros. Diminua o foco do laser para cerca de 300 nanômetros ou o plano focal das contas de calibração para produzir uma resolução clara das contas individuais.
Uma vez que o plano Z esteja focado, ajuste ainda mais os níveis de potência do laser para explicar a variação em cada campo de visão. Nas funções do Instrumento, a calibração completa do mapeamento 3D e a calibração do mapeamento do canal para obter os erros no eixo X, Y e Z. definir o número máximo de campos de visão para 20, o número de alvo de pontos para 4.000, a distância máxima entre os canais para 5,0 pixels e o raio de exclusão entre os canais para 10,0 pixels durante a calibração do mapeamento do canal.
Certifique-se de que a calibração produz uma cobertura de ponto superior a 90% e qualidade de mapeamento que seja boa. Salve os dados de calibração dado para futuras aquisições de imagens. Adicione óleo 100X ao objetivo e coloque os EVs preparados no microscópio.
Sem ativar a lente 3D, ligue o laser de excitação de 640 nanômetros e, inicialmente, eleve-o entre 1,2 e 12,5 miliwatts, dependendo da intensidade do sinal no campo de visão para excitar a membrana vermelha, intercalando, corantes e EVs manchados de corante. Nas opções de exibição de imagem, alterne o método de visualização da saturação de fótons para percentis para melhor visualizar os EVs. Ajuste a potência do laser para minimizar o ruído enquanto maximiza o sinal e mantenha todos os outros parâmetros.
Ajuste o foco do plano Z clicando no ícone para cima ou para baixo no eixo Z. Ajuste o tempo de exposição para 20 milissegundos, a captura do quadro para 10.000 quadros e a potência inicial do laser entre 1,2 e 12,5 miliwatts, dependendo da intensidade do sinal e do campo de visão. Ative a lente 3D usando o ícone e inicie a aquisição clicando no botão Adquirir.
Durante todo o processo de aquisição de imagens, eleve a potência laser em três incrementos de 10 a cada 1000 quadros, ou o suficiente para manter uma alta relação sinal-ruído. Não ajuste o plano Z durante a aquisição. Após a aquisição da imagem, alterne para a janela de visualização Analisar.
Execute a correção de deriva na imagem não filtrada e, em seguida, ative filtros. Ajuste a contagem de fótons, precisão de localização, sigmas e índice de quadros, como mencionado no manuscrito. Sobreponha uma ferramenta de visão X, Y, Z-plane ao longo do eixo X de EVs individuais a partir do campo de exibição e exporte os arquivos csv individuais de eventos de fototaria.
Bisecte EVs individuais no eixo X, eixo Y em um campo de visão X by Y usando uma ferramenta Desintoxicação de linha, que fixa eventos de fotossar em grupos de distância definidos. Pegue imagens de EVs únicos e salve-as como arquivos tif. Crie vídeos 3D de EVs individuais usando uma ferramenta de visualização 3D e cor de acordo com a colocação ao longo do eixo Z.
Após a calibração do microscópio que produziu um erro médio de 16 nanômetros no eixo X, Y e 38 nanômetros no eixo Z, os EVs u20 purificados foram visualizados com sucesso com uma resolução de até 20 nanômetros no eixo X, Y e 50 nanômetros ao longo do eixo Z. EVs individuais visualizados através de dSTORM em fotos 3D enfeitiçados ao longo da exposição de 10.000 quadros à medida que a potência do laser foi aumentada, e foram facilmente aparentes na imagem adquirida. Correção de imagem pós-aquisição no plano Z, contagens de fótons, sigmas e precisão de localização da imagem reconstruída resultaram em uma resolução clara do EV em 3D.
O EV se trançou durante apenas os primeiros 7.000 quadros, como visto pela lenda no canto superior direito. O histograma confirma que a maioria dos eventos de fototareça ocorreram dentro de um raio de 100 nanômetros, validando que o EV visualizado é um exosoma, e que o isolamento de EVs de um pequeno diâmetro foi bem sucedido. A análise de distribuição de tamanho realizada em outros EVs com rastreamento individual usando a ferramenta Line Histogram e a ferramenta X, Y, Z-plane View confirmaram que a maioria dos eventos de fotossarcimento ocorreu dentro de um raio de 100 nanômetros do centro.
O erro ao longo do eixo Z foi aumentado, produzindo uma imagem final alongada do EV ao longo do eixo axial. Os eventos de fotossarquivamento não foram correlacionados com o tamanho do EV, demonstrando que a caracterização baseada em dSTORM pode ser usada para pequenos EVs como exosósmos e vírus pequenos e envoltos com menos de 100 nanômetros de diâmetro. Ao realizar dSTORM é importante lembrar de definir a potência do laser inicial muito baixa, e lentamente levantá-la durante toda a aquisição de imagem, a fim de evitar fotobleaching.
Desde o seu desenvolvimento, o dSTORM permitiu que os pesquisadores entendessem melhor a morfologia das estruturas subcelulares que antes eram impossíveis de visualizar devido ao limite de difração da microscopia de luz típica.
