Esses métodos permitem uma avaliação rápida sobre se uma manipulação experimental, proteína causadora de doenças ou RNA podem impactar processos sinápticos e se compostos terapêuticos podem restaurar a função. Essas técnicas fornecem uma leitura confiável da função sináptica de um grupo de neurônios em um período relativamente curto de tempo em comparação com a eletrofisiologia. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer doença de desenvolvimento neuronal ou degeneração.
Isso funciona bem para culturas neuronais de roedores primários, e para neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas. Para começar, otimize as configurações de aquisição de imagens usando o software de aquisição de imagens confocal. Mantenha o tempo de exposição de energia de excitação, o ganho do detector e a taxa de quadros constantes em todas as amostras.
Para imagens de lapso de tempo, selecione uma proporção de 512 por 512 e uma taxa de quadros de duas imagens por segundo para minimizar o branqueamento de corantes. Em seguida, selecione as combinações de excitação de fluorescência, dicroica e filtro de emissão para GCaMP seis M/GCaMP três com Fitzy e corante estearoyl com Trixi. Para evitar o drift Z durante a imagem de lapso de tempo, use o recurso de foco perfeito do software de aquisição de imagens confocal.
Em seguida, selecione a guia de tempo no painel de aquisição de imagens. Para a fase um, defina o intervalo de 500 milissegundos e a duração de três a cinco minutos. E para a fase dois, definir intervalo de 500 milissegundos e duração, cinco minutos.
Em seguida, para montar o aparelho de perfusão de gravidade para fluido cerebrospinal artificial ou ACSF, carregue o alto tampão de cloreto de potássio ACSF em uma seringa de 50 mililitros na parte superior do aparelho e defina a taxa de fluxo para um mililitro por minuto. Em seguida, carregue um prato de vidro de 35 mililitros contendo neurônios no estágio de imagem confocal com a extremidade da tubulação de perfusão colocada na borda do prato e escolha o campo para a imagem. 48 horas após a transfecção, incubar os neurônios cortical ou motor primários no tampão ACSF de cloreto de potássio baixo por 10 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, remova o tampão por aspiração e usando uma pipeta, carregue os neurônios no escuro em uma placa de Petri de fundo de vidro preenchida com ACSF contendo 50 milimolars de cloreto de potássio e 10 Micro corante de estiling molal. Após cinco minutos, remova a solução de carregamento e banhe os neurônios em baixo tampão de cloreto de potássio ACSF a 37 graus Celsius por 10 minutos para eliminar o carregamento de corante não específico. Em seguida, coloque o prato sobre o estágio de imagem do microscópio confocal invertido e observe as células sob um objetivo de 20 vezes o ar ou 40 vezes objetivo de imersão em óleo.
Excite o corante de aço usando um laser de 546 nanômetros e colete emissões usando um filtro de bandpass de 570 a 620 nanômetros. Depois de selecionar o campo de imagem e engajar o foco perfeito, pegue uma única imagem parada com canais de marcadores de trixi e fluorescência para marcar limites neuronais. Em seguida, inicie o Run Now no software de aquisição e realize a gravação basal por três a cinco minutos para excluir variações na intensidade do corante.
Logo na mudança para a fase dois, acione o botão on para o sistema de perfusão e perfusa constantemente 50 milimolars de cloreto de potássio para os neurônios para facilitar a descarga de corantes. Realize as gravações por cinco minutos e acione o interruptor de desligamento para o sistema de perfusão. Salve o experimento para análise de dados mais tarde usando o software confocal.
48 horas após a transfecção com GCaMP seis M, incubar os neurônios cortical do roedor primário com cloreto de potássio baixo ACSF por 15 minutos. Em seguida, monte o prato na plataforma de imagem e visualizou gCaMP seis M fluorescência usando um filtro Fitzy e um objetivo de 20 vezes ou 40 vezes. Depois de selecionar o campo de imagem e engajar o foco perfeito, pegue uma única imagem parada com canais marcadores de campo brilhante, Fitzy e fluorescência para marcar limites neuronais.
Em seguida, inicie o Run Now no software de aquisição e realize a gravação basal por três a cinco minutos. Em seguida, perfuse ACSF contendo 50 milimila cloreto de potássio para os neurônios como demonstrado anteriormente e gravar por cinco minutos. Quando a aquisição de imagem parar, salve o experimento e prossiga para a análise de dados usando o software confocal.
Para análise de imagem, abra as imagens de lapso de tempo no software confocal e alinhe as imagens clicando em Imagem, seguido de processamento, seguido de documento atual de alinhamento e selecione Alinhar ao primeiro quadro. Selecione regiões de interesse ao longo dos neuritos usando a ferramenta de seleção do ROI e também marque um ROI representando a intensidade da fluorescência de fundo. Em seguida, inicie a função de medida a partir do painel de medição de tempo para medir a fluorescência bruta ao longo do tempo para os ROIs selecionados.
Após a medição exportar as intensidades de fluorescência bruta para o software de planilha. Neurônios corticais primários de ratos cultivados carregados com corante de estilingues são mostrados aqui. A especificidade do carregamento de tingimento foi determinada pela co rotulagem com sinástia de marcador de vesícula sináptica e a maioria dos puncta positivos de corante estéril são co positivos para este marcador.
A análise dos valores de intensidade bruta durante todo o período de imagem revela que a sináplofia e a intensidade permanecem constantes enquanto a intensidade do corante estilado diminui após a estimulação. Para os neurônios de controle transfectados de proteínas fluorescentes verdes, a liberação bem sucedida de vesícula sináptica resultou na perda impressionante da fluorescência de corantes após a despolarização do cloreto de potássio. Este vídeo representativo mostra um neurônio descarregando seletivamente corante de estirpe em uma nova região direita após a estimulação.
Em contraste, em neurônios transfectados com um C nove ORF 72 ligado à construção de repetição de peptídeos de corante à GA 50, a transmissão sináptica prejudicada é representada por fluorescência de corante retido mesmo após alta despolarização do cloreto de potássio. Imagens representativas de fluorescência de neurônios corticais transfectadas com GCaMP seis M antes e depois da despolarização do cloreto de potássio são mostradas aqui. O aumento dos valores de fluorescência e os neurônios corticais transfeccionados com GCaMP seis M indicam entrada de cálcio em neurites após a despolarização do cloreto de potássio.
No final do período de gravação da linha de base, os neurônios expressaram GCaMP seis M com baixa fluorescência. Um aumento dramático da fluorescência é então observado no início da estimulação. Certifique-se de que as gravações da linha de base da fluorescência para corante de estilingues e GCaMP estejam estáveis.
Use sempre o foco perfeito para evitar a deriva da imagem, o que tornaria o processamento de dados de postagem desafiador. Não é recomendado a cultura adicional de neurônios, pois os pratos são expostos ao ar durante a profusão. No entanto, a coloração ou extração de proteínas ou RNA pode avaliar as causas potenciais de alterações sinápticas.
