Este protocolo pode ajudar os pesquisadores a separar facilmente as retinas dos camundongos e observar as mudanças dinâmicas na vasculatura da retina do modelo de rato OIR. As principais vantagens deste método são a preservação da integridade das retinas separadas e permitir que cada rato sirva como seu próprio controle, o que torna os resultados mais comparáveis. Pesquisadores que tentam esse método pela primeira vez podem ter dificuldade ao tirar as cinco imagens de orientação porque é um pouco difícil colocar filhotes na posição correta.
Para coletar o tecido para montagem inteira da retina, use uma tesoura curva para desconectar os globos oculares do tecido orbital de um filhote de C57-Black/6 eutanizado. Em seguida, insira fórceps curvos na parte posterior do globo ocular, apertando o nervo óptico e rapidamente levantando o olho para fora da órbita. Coloque os globos oculares em PBS pré-resfriado para remover qualquer cabelo e sangue da superfície.
Quando todos os globos oculares tiverem sido coletados, transfira os globos oculares limpos para um tubo de microcentrífugo de dois mililitros contendo 4% de paraformaldeído, e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente e 12 a 15 revoluções por minuto. No final da incubação, adicione uma gota de PBS ao centro de um prato de cultura sob um microscópio dissecando, e coloque um globo ocular na queda. Segurando o globo ocular com um par de fórceps, use uma agulha de seringa de um mililitro para perfurar cuidadosamente a córnea no limbus da córnea.
Insira a ponta de uma tesoura na punção e corte a córnea ao longo do limbus da córnea, tomando cuidado para não cortar a retina. Use fórceps para remover a íris e a lente, e coloque a xícara ocular restante em 4% de paraformaldeído para uma incubação de 45 minutos à temperatura ambiente no agitador. No final da incubação, coloque a ocular fixa em uma nova gota de PBS no centro de um novo prato de cultura.
Segurando a xícara ocular com um par de fórceps, use um segundo par de fórceps para separar suavemente as camadas de retina e esclera. Coloque a ponta da tesoura entre as camadas de retina e esclera e corte a esclera em direção ao nervo óptico. Retire a esclera da retina para obter o copo de retina.
Usando fórceps, solte a conexão entre os vasos hialoides radiais e a retina periférica. Use uma pipeta de dois mililitros com a ponta cortada para transferir o copo de retina em um poço de uma placa de 48 poços para três lavagens de cinco minutos em temperatura ambiente PBS no shaker. Após a última lavagem, incubar o copo em 1%Triton X-100 e 5% soro de burro normal na PBS durante a noite a quatro graus Celsius.
Para rotular a vasculatura de retina com isolectina B4, incubar a retina em um poço de uma placa de 48 poços em 400 microliters 0,1% soro de burro normal complementado com isolectina B4-594 durante a noite a 4 graus Celsius em um shaker. Se necessário, outro anticorpo primário pode ser adicionado ao mesmo tempo. No dia seguinte, lave a retina com três lavagens de 20 minutos em 0,1%PBST no shaker.
Após a última lavagem, incubar a retina com um anticorpo secundário de alta afinidade apropriado por uma hora à temperatura ambiente antes de rotular a amostra com DAPI por 20 a 25 minutos. No final da incubação, lave a retina com três lavagens de 30 minutos em 0,1%PBST em temperatura ambiente com agitação. Após a última lavagem, transfira o copo de retina para um slide limpo com a abertura voltada para cima, e use o microscópio para cortar a retina radialmente nas posições de três, seis, nove e 12 horas da periferia em direção ao centro, até um a 1,5 milímetros da cabeça do nervo óptico.
Enxágüe a retina três vezes com algumas gotas de PBS por lavagem antes de usar papel colocado a ar para secar e achatar a retina. Adicione uma gota de meio de montagem ao centro da mancha de cobertura até que o diâmetro da gota cubra metade do deslizamento de cobertura. Em seguida, coloque rapidamente o deslizamento de cobertura montando lado médio para baixo na retina outspread.
Uma vez que todas as montagens planas da retina tenham sido preparadas, as amostras podem ser imagens por microscopia de fluorescência confocal. Para imagens in vivo, adicione 20 microliters de colírios micráticos para alcançar a dilatação da pupila de longa duração. Após cinco minutos, coloque os filhotes em posição estável em uma pequena almofada de aquecimento na frente do dispositivo de imagem.
Para manter a umidade nas córneas, adicione regularmente lágrimas artificiais durante todo o procedimento de imagem. Em seguida, clique em Infrared Fundus Imaging no dispositivo para ajustar a cabeça do nervo óptico para o centro da tela. Injete intraperitoneally 150 microliters de solução de sal de sódio fluoresceína de 0,5%, e clique imediatamente nos botões FA e Injection no painel de toque do dispositivo de imagem para iniciar o temporizador.
Após três minutos, quando a circulação sanguínea da retina entrou na fase venosa, adquire a primeira imagem da retina central. Mova a lente do dispositivo de imagem horizontalmente para o lado nasal do olho até que a cabeça do nervo óptico esteja localizada no ponto médio de um lado da área de aquisição de imagens, e tire a segunda imagem. Continue movendo a lente e adquirindo imagens da retina temporal, superior e inferior da mesma forma.
Para processar as imagens da retina em um programa de processamento de imagens apropriado, abra o menu Arquivo e clique em Novo para criar uma nova tela com fundo preto. Abra a imagem da retina central. Em seguida, clique em Arquivar para adicionar uma segunda imagem.
Ajuste a opacidade da segunda imagem para 60% e mova-se e redimensione a imagem até que as duas imagens se sobreponham. Clique em Alternar entre modos de transformação livre e dobra e faça ajustes sutis nas embarcações, se necessário. Em seguida, defina a opacidade da segunda imagem de volta para 100% Selecione ambas as imagens e clique em Auto-Blend Layers.
Verifique o Panorama como o método de mistura e também verifique as caixas para obter tons e cores e cores e áreas transparentes de preenchimento conscientes de conteúdo. Clique em OK para completar a costura das duas primeiras imagens. Em seguida, adicione a terceira imagem, e costure esta imagem para as duas primeiras imagens como demonstrado até que todas as cinco imagens de uma única retina tenham sido costuradas.
Quando todas as imagens da análise tiverem sido processadas, use a Ferramenta crop para cortar as imagens ffa em um tamanho uniforme para facilitar a observação das mudanças na dinâmica da vasculatura da retina em diferentes pontos de tempo de desenvolvimento. Após cinco dias de exposição à hiperoxia, as retinas centrais do pós-natal 12 filhotes demonstram uma grande área de não perfusão. Ao transferir para cinco dias de condições hipóxiis, as retinas gradualmente se neovascularizam, apresentando um aumento no sinal de fluorescência mais forte do que o observado nos vasos normais circundantes.
Após o pós-natal 17, a neovascularização patológica regrede rapidamente e a retina demonstra uma aparência completamente normal até o pós-natal 25. Uma boa repetibilidade e estabilidade do modelo de retinopatia induzido pelo oxigênio podem ser alcançados controlando o tamanho da ninhada e o ganho de peso pós-natal dos filhotes. Como observado, a vaso-obliteração normalmente atinge o pico no pós-natal 12 e desaparece no pós-natal dia 25, enquanto a neovascularização atinge o pico no pós-natal 17 e regrede até o pós-natal dia 25.
No pós-natal de 15 a 25 camundongos de retinopatia induzidos pelo oxigênio, o diâmetro do vaso sanguíneo da retina aumenta e se torna altamente torturante em comparação com o observado para as retinas de camundongos normais. Os fórceps na mão esquerda desempenham principalmente um papel coadjuvante. Tome cuidado para não apertar o globo ocular, que pode deformá-lo ou rompê-lo.
