Este protocolo pode ajudar cientistas interessados em estudar a função molecular dos astrócitos humanos em seu nicho nativo. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o isolamento e o enriquecimento de um tipo celular específico, astrócitos adultos de amostras de tecido cerebral humano em massa usando a triagem de núcleos ativados pela fluorescência. Essa metodologia pode ser aplicada à isolação de outros tipos celulares do neocórtex humano, como neurônios e células progenitoras de oligodendrocyte usando outros anticorpos conjugados fluorescentes apropriados.
Comece a dissecar aproximadamente 200 a 400 miligramas de tecido de uma amostra de tecido córtex adulto adulto congelado. Coloque o tecido em um douncer de tecido de vidro de sete mililitros contendo quatro mililitros de tampão de lise gelada no gelo e triture o tecido aproximadamente 50 vezes. Transfira o homogeneizar para um tubo de polipropileno ultracentrifuge de 12 mililitros.
Use uma pipeta de cinco mililitros para adicionar 6,5 mililitros de tampão de sacarose gelada ao fundo do tubo ultracentrífuga sem perturbar a interface entre a sacarose e o tecido homogeneizar. Para coletar os núcleos, ultracentrize o lysate por uma hora a 101, 814 vezes G e aspire cuidadosamente o supernascido e detritos sem perturbar a pelota. Adicione 0,1% BSA em PBS ao tubo de ultracentrícula para uma incubação de 10 minutos no gelo antes de reutilizar a pelota dos núcleos.
Em seguida, use o azul trypan para visualizar os núcleos intactos sob um microscópio leve e para garantir que a concentração seja superior a 10 a 5 núcleos por mililitro Para a triagem ativada pela fluorescência dos núcleos isolados, adicione aproximadamente 20 microlitros da amostra resuspended a uma solução de anticorpo contendo o anticorpo anti-NeuN do flúor alexa 555. Adicione aproximadamente 20 microliters da amostra resuspended a uma solução de anticorpos contendo anticorpo anti-PAX6 conjugado pelo rato conjugado aPC. Após uma incubação de uma hora a quatro graus Celsius com agitação, protegido da luz, adicione DAPI a uma proporção de 1:1000 a todas as amostras e controles.
Para incluir núcleos do tamanho apropriado e excluir glóbulos vermelhos e detritos, use um tubo de controle para gate as células por suas áreas de dispersão dianteira e lateral. Para selecionar a população de núcleos singlet, portão por área de dispersão dianteira versus largura de dispersão dianteira ou área de dispersão lateral versus largura ou altura de dispersão lateral. Portão da DAPI para incluir apenas os núcleos intactos e excluir quaisquer detritos e dobras.
Depois de gating de acordo com quaisquer controles adicionais de fluorescência, execute a amostra de controle somente DAPI. Execute o controle apenas de fluor 555 da NeuN Alexa para determinar o corte para a mancha neun positiva no canal Alexa fluor 555. Execute o controle PAX6 somente APC para determinar o corte para a coloração PAX6-positive no canal APC.
Depois de todos os controles terem sido executados, gate as células NeuN-positive para coletar os neurônios e gate as células PAX6 positivos com a população NeuN-negativo para coletar os astrócitos. Portão e coletar quaisquer populações gliais adicionais de interesse da população PAX6-negativa neun. Para sequenciamento de RNA de núcleo único a granel, depois de coletar 50.000 a 500.000 núcleos em PBS 0,04%BSA complementado, adicione dois mililitros de solução de sacarose, 50 microliters de cloreto de cálcio de um molar e 30 microlitres de acetato de magnésio de um molar à amostra.
Leve o volume final da suspensão até 10 mililitros com PBS. Misture o conteúdo do tubo por inversão e incubar a reação no gelo por 15 minutos. Pellte os núcleos por centrifugação e resuspenda os núcleos em um mililitro de reagente extraindo RNA.
Em seguida, vórtice do tubo, congele a amostra em gelo seco, e armazene os núcleos a menos 80 graus Celsius. Para sequenciamento de cromatina de núcleo único em massa, colete 50.000 a 75.000 núcleos em PBS 0,04% de BSA em um tubo de microcentrifuge revestido com 5%BSA e congele os núcleos até sua análise a jusante. Populações progenitoras neuronais, astrócitos e oligodendrocyte podem ser classificadas a partir de uma nova amostra de neocórtex temporal humano pós-morte congelada, como demonstrado.
Estudos de sequenciamento de RNA de núcleo único priorizaram ainda mais o PAX6 como um fator de transcrição nuclear expresso diferencialmente em subpopulações de astrócitos adultos protoplasmáticos e fibrosos. Após a classificação, podem ser caracterizadas alterações de transcriptome específicas do tipo celular no neocórtex da epilepsia patológica primária. Nesta análise, análises transcriômicas confirmaram que as populações neun-negativas pax6-positivas foram robustamente enriquecidas para marcadores panastrocitis e esgotadas para marcadores neuronais.
A coloração da imunofluorescência pode ser usada para confirmar a co-localização do PAX6 com proteína ácida fibrilar gliana em astrócitos cortical humanos. Intervalos pós-morte mais curtos estão associados a uma maior recuperação de núcleos intactos de amostras de tecido fresco. Um alto rendimento de núcleos intactos pode ser recuperado de tecido congelado até 24 horas após a morte, mas em 30 horas, muito poucos núcleos intactos podem ser recuperados.
A coisa mais importante a se lembrar é obter a população PAX6-positiva da população NeuN-negativa, porque há neurônios que também expressam PAX6, e queremos excluir esses. Essa técnica também permitiu o estudo de astrócitos em amostras cerebrais cirúrgicas de epilepsia, elucidando ainda mais a desregulação molecular dos astrócitos humanos no contexto de um nicho patológico específico.
