A metástase é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer. Esse fenômeno ocorre quando as células cancerígenas se desprendem do tumor primário, entram na circulação sanguínea para finalmente atingir um órgão alvo distante. Uma vez que essas células separadas vão para o sangue, nós as chamamos de células tumorais secundárias.
Eles representam um material variável porque, por um lado, eles são os principais culpados da formação de metástase e, por outro lado, são mais fáceis do que biópsias tumorais. Na verdade, eles podem ser coletados por uma simples punção sanguínea. Apesar do baixo número dessas células na amostra de sangue, somos os primeiros a estabelecer várias linhas de células tumorais circulantes do sangue do paciente com maior preocupação usando a condição controlada em 3D.
Esta linha celular pode ser usada em qualquer linha de células comerciais para experimentos de rotina. Por exemplo, para a triagem genética de medicamentos, para proteína de interesse, mas também para o experimento in vivo para testar a capacidade de iniciação do tumor e seu potencial metastático. CTC, circulando linhas de células tumorais, deve ser cultivado em condições 3D em hipóxia.
Uma vez que o CTC tenha formado esferas, podemos colocá-la no meio e centrífugar-a por cinco minutos a 300 RCF. Descarte o supernatante e adicione 500 microliters de Accumax. Suspendemos um e incubamos a solução 20 minutos a 37 graus.
Em seguida, lave esferas dissociadas com PBS e pelota as células. Resuspenque a pelota com um DMEM/F12 recém-suplementado e veja as células na densidade de cinco células por microliter em uma nova placa de 24 Low Attachment. As esferas de CTCs de centrifugação eliminam o supernasce e lavam a pelota duas vezes com PBS.
A 500 microliter de PFE misture bem e incuba o tubo no gelo por 20 minutos. Em seguida, centrifugar as esferas fixas e lavar a pelota duas vezes com PBS, eliminando o volume máximo de PBS e adicionar 20 microliter de HistoGel formado. Leve-o para a suspensão e faça uma gota no vaso de cultura, deixe-o secar por 10 minutos e desprender-o usando um bisturi.
Agora você pode processar para qualquer desejado, a fim de CTCs visando uma proteína desejada de interesse. Coletar CTCs e desassociar as esferas com a Accumax como descrito anteriormente. Elimine o Accumax e resuspenja a pelota com três mL de tampão de bloqueio e transfira a suspensão através de um coador de células de 14 micrômetros para obter uma solução celular única.
Conte as células e envie em tubos e adicione um volume de 200.000 células, centrifugue os tubos e descarte o sobrenante. De acordo com a folha de dados de anticorpos, adicione em um tubo, o volume desejado do anticorpo e em outro tubo seu isótipo e continue os passos seguindo a orientação do fabricante. O tubo restante não será rotulado e o uso de um mercado de viabilidade é fortemente sugerido neste experimento.
No cítmetro, comece com o tubo não rotulado para definir a tensão na área negativamente rotulada. Depois disso, coloque o tubo de isótipo. O isótipo serviria como um controle negativo para distinguir entre o sinal positivo e o sinal não específico.
E termine o experimento com as células rotuladas com o anticorpo de interesse onde você deve ver uma mudança no portão rotulado positivamente, se a proteína de interesse for expressa. Isso suspende ctcs dissociados em meio suplementado na densidade de 200.000 células por mL. Em um ultra baixo acessório 96, placa bem, selar o volume de 50 microliter e incubar a placa 24 horas em hipóxia.
No dia seguinte, adicione 50 microliter de diferente concentração da droga testada e adicione o mesmo volume de DMEM/F12 apenas para determinar ainda mais a base de viabilidade celular e incubar a placa por mais 48 horas. No terceiro dia, reconstitua o agente e adicione 70 microliter da mistura em cada poço. Coloque a placa em um agitador orbital por 20 minutos e, em seguida, meça a luminescência.
Este ensaio é uma ferramenta útil para testar um grande número de medicamentos, a fim de avaliar seus efeitos no crescimento celular do CTC. Em Eppendorf, células resuspend em 100 microliter de PBS beliscam a pele na parte de trás do mouse e inserem a agulha sob a pele. Injete lentamente todo o volume no mesmo local e monitore o crescimento do tumor a cada segundo dia e sacrifique os camundongos se o tumor excedesse um tamanho de 1,5 centímetros cúbicos.
Antes da cirurgia, injete subcutâneamente um analgésico, no lado ventral dorsal do camundongo, faça uma pequena incisão abaixo da 10ª costela. Levante suavemente o baço e coloque-o em uma gaze estéril. Usando uma seringa de insulina, injete 50 microliteres de CTCs resuspended em PBS e espere por três minutos sem remover a agulha.
Ligate o vaso arterial de um lado e o vaso venal do outro lado. Em seguida, remova o baço cortando diretamente acima das duas ligaduras. Costure o peritônio abdominal e a pele e desinfete bem a área.
O objetivo deste experimento é testar a capacidade de CTCs derivados de pacientes com câncer colorretal para colonizar o fígado induzindo a previsão metastática visível. Isolar e estabelecer a linha celular tumoral clínica é uma ferramenta emergente para estudos fundamentais e translacionais. Por exemplo, se você tem um gene de interesse onde os estudos in vivo demonstraram que esse gene está envolvido na migração e capacidade de invasão de linhas de células cancerígenas colorretais, derrubar esse gene em linhas de células tumorais circulantes antes da injeção no baço de camundongos, deixá-los colonizar o fígado pode ser uma boa ferramenta para confirmar seu resultado in vivo.
Para estudos translacionais, nossa principal perspectiva de isolar linhas de células tumorais circulantes é usar esse precioso material em medicina personalizada. A partir das amostras de sangue do paciente, isolaríamos e amplificamos CTCs na cultura por duas ou três semanas, a fim de ter material suficiente para examinar o painel de medicamentos que está disponível e avaliar sua citotoxicidade para finalmente atribuir
