Este protocolo apoia a caracterização do papel dos genes de mosquitos envolvidos em uma variedade de vias fisiológicas, incluindo, por exemplo, resistência a insetos e desenvolvimento de parasitas da malária. O método impulsiona a inserção de transgenes em locais genômicos pré-caracterizados e, portanto, permite comparar diretamente fenótipos resultantes de transgênicos alternativos, evitando efetivamente a questão do efeito posicional. Este método pode ser aplicado a uma variedade de espécies de insetos de saúde pública e importância agrícola e suas aplicações se estendem amplamente de bactérias a células de mamíferos.
Comece projetando plasmídeos doadores attB carregando o marcador fluorescente dominante, os locais de recombinação attB e a carga transgênica desejada. Use um único site attB para integração de todo o plasmídeo carregando o transgênico ou dois locais attB invertidos para troca de. Purificar plasmídeos doadores e ajudantes usando um kit de purificação sem endotoxina.
Combine o plasmídeo doador marcado attB carregando o transgênico de interesse e o plasmídeo auxiliar carregando o integrase para obter uma mistura com uma concentração final de 350 nanogramas por microliter do plasmídeo doador e 150 nanogramas por microliter do plasmídeo auxiliar. Precipitar o DNA adicionando 0,1 volume de três acetato de sódio molar e 2,5 volumes de gelo frio 100% etanol, depois vórtice. Um precipitado branco deve ser imediatamente visível.
Lave a pelota e resuspenja-a em tampão de injeção para atingir uma concentração final total de 500 nanogramas por microliter. Em seguida, prepare alíquotas de 10-15 microliters cada e armazene-os a 20 graus Celsius negativos. O sangue alimenta mosquitos de quatro a sete dias de idade da linha de acoplamento desejada e seus tipos selvagens contrapartes 72 horas antes da micro injeção.
Realize micro injeções de embrião anofelinos em 25 mililitros de sódio mirando o polo posterior do embrião em um ângulo de 45 graus. Execute micro injeções de embrião Anopheles stephensi em óleo de halocarboneto mirando o polo posterior em um ângulo de 30 graus. Imediatamente após a injeção, transfira os ovos para uma placa de Petri cheia de água destilada estéril e devolvê-los às condições insetídas.
Após a eclosão, transfira a larva G0 para uma bandeja com água salgada destilada diariamente e volte para pupas. Classificar G0 pupae por sexo sob um estereoscópio. Permita que os machos emerjam em gaiolas separadas em grupos de três a cinco anos e adicione um excesso de dez vezes mais de fêmeas do tipo selvagem com correspondência etária.
Permita que as fêmeas emerjam em gaiolas separadas em grupos de 10 a 15 anos e adicione um número igual de machos selvagens com idade compatível. Permita que os adultos acasalem por quatro a cinco dias e forneçam às fêmeas uma refeição de sangue. Recolhe os ovos e a traseira emergentes da próxima geração G1s.
Colete larva G1, L3 e L4 em uma placa de Petri forrada com papel filtro molhado ou em um slide de microscópio e tela-as usando um estereoscópio fluorescente para a presença do marcador introduzido com a carga etiquetada attB. Para designs attB únicos, tela para a presença do marcador novo e pré-existente. Para designs de attB duplo para troca de, tela para a presença do novo marcador e a perda do pré-existente.
Sort transformou g1 pupae por sexo e cruzá-los em massa com indivíduos do tipo selvagem do sexo oposto. Permita que os adultos acasalem por quatro a cinco dias e forneçam uma refeição de sangue. Para experimentos de integração simples, colete ovos diretamente da cruz em massa.
Para experimentos de troca de, colete ovos de fêmeas solteiras e mantenha a prole separada até que a avaliação molecular seja completa devido à presença potencial de duas orientações alternativas de. Trie a prole G2 para a presença do marcador fluorescente e reserve um subconjunto de indivíduos positivos G2 para análise molecular. Coloque o resto para a idade adulta.
Realizar validação molecular dos locais de inserção com PCR conforme descrito no manuscrito do texto. Para uma única integração, certifique-se de que o local de inserção previsto carregue a construção original de acoplamento, além de toda a sequência do plasmídeo doador entre os dois locais híbridos attL e attR. Para troca de, certifique-se de que o local de inserção previsto seja idêntico ao da linha de encaixe onde os sites híbridos invertidos de ATTL substituam os locais originais invertidos de attP e o modelo de troca substitui o originalmente presente entre eles.
O protocolo foi utilizado para gerar uma linha transgênica anopheles estável em aproximadamente 10 semanas. A validação fenotípica da transformação foi realizada por triagem de marcadores fluorescentes regulados pelo promotor 3xP3. Uma nova linha Anopheles stephensi foi obtida pela inserção de um vermelho DS em uma linha de acoplamento marcada com CFP que resultou em prole G1 expressando ambos os marcadores como indicado pela fluorescência vermelha e azul nos olhos.
Os desenhos de troca de resultam na substituição do marcador originalmente inserido na linha de acoplamento com o doador. Esta troca de marcadores foi demonstrada em uma linha de acoplamento Anopheles gambiae onde o marcador CFP foi perdido e o marcador YFP adquirido resultando em fluorescência de olho amarelo e cordão nervoso. Ocasionalmente, o RMCE pode resultar em um único evento de integração em vez da troca do transgênico desejado onde uma larva é marcada tanto com os marcadores CFP originais quanto com os novos marcadores YFP.
Ao triagem para a presença de um marcador fluorescente, é crucial distinguir seu sinal de uma possível auto-fluorescência de fundo. Aumentar a ampliação e focar nos tecidos e órgãos onde se espera que a fluorescência seja impulsionada pelo promotor é necessário para identificar verdadeiros indivíduos positivos do PCP. Os transformadores individuais também foram avaliados molecularmente via PCR para confirmar o local de inserção esperado.
A validação do PCR em indivíduos de uma linha de câmbio Anopheles gambiae é mostrada aqui. Mesmo a técnica de micro injeção adequada, o design e a preparação precisos dos plasmídeos doadores e ajudantes, bem como seguir o esquema adequado de criação de mosquitos são fundamentais para a obtenção de indivíduos transgênicos. Este procedimento pode ser usado para inserir elementos que causam excesso de expressão genética ou silenciamento, por exemplo, o sistema GAL4/UAS, bem como elementos de unidade genética e moléculas anti-patógenos para controle genético de mosquitos.
